[发明专利]一种重组大肠杆菌及合成四氢嘧啶的应用

说明书

本发明提供一种重组大肠杆菌及合成四氢嘧啶的应用，所述重组大肠杆菌是将大肠杆菌E.coli MG1655的二氨基庚二酸脱羧酶lysA基因敲出，并导入核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示四氢嘧啶合成基因簇ectABC获得的。所述二氨基庚二酸脱羧酶lysA基因核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。本发明诱导表达后的菌体以L‑天冬氨酸钠为底物，生物转化制备四氢嘧啶。转化20‑30h后，四氢嘧啶产量达到2.5‑3.5g/L，具有较好的工业应用价值。

(一)技术领域

本发明涉及一种重组大肠杆菌全细胞转化合成四氢嘧啶的方法，属于基因工程和生物技术领域。

(二)背景技术

海洋微生物为了适应深海的高盐条件，需要依赖于一种被称为相容性溶质机制的策略(Compatible-Solutes，Strategy)，来抗衡外界盐环境形成的负面影响，维持渗透压平衡。根据化学结构，相容性溶质主要包括：①糖类及衍生物：蔗糖、海藻糖、甘油葡萄苷等；②多元醇类及衍生物：甘油山梨醇、甘露醇等；③氨基酸及衍生物：脯氨酸、谷氨酸、丙氨酸、四氢嘧啶、5-羟基四氢嘧啶等；④甜菜碱类：甜菜碱、甘氨酸甜菜碱、脯氨酸甜菜碱。相容性溶质作为细胞的渗透压保护剂，有很好的稳定生物大分子的功能，对细胞内的蛋白酶和其它大分子物质起着抗热、抗冻和抗变性等稳定作用。

四氢嘧啶(1,4,5,6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸，Ectoine)，是目前发现分布最广泛的相容性溶质，它与细胞相容性好，高浓度的积累可对抗渗透压冲击，且不干扰细胞的新陈代谢和蛋白质的正确折叠，甚至具有稳定蛋白质结构的作用，被广泛的运用：①被称为“分子伴侣”保护生物大分子；②蛋白质与酶分子稳定剂；③DNA结构稳定和保护剂；④生物医药，如阿尔兹海默氏症、帕金森病、结肠炎等疾病的治疗过程均有一定的作用，并且最新研究发现四氢嘧啶能够提高皮肤的再生能力、延缓其老化和抑制黑色素的生成，可作为安全的化妆品保湿剂与增白剂。⑤据报道，高纯度的四氢嘧啶市场价约$1300/kg。其结构式如下：

由于四氢嘧啶的手性结构和最初可分离到的菌株四氢嘧啶产量极低，而且化学合成成本很高，很难直接应用于商业用途，导致四氢嘧啶的相关研究进展难以推进。目前，以天冬氨酸钠为底物，采用重组大肠杆菌进行全细胞生物催化生成四氢嘧啶，已广泛应用于四氢嘧啶的大规模生产。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种产生四氢嘧啶的工程菌、构建方法及制备四氢嘧啶的方法，为后续工业化生产四氢嘧啶奠定基础。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种产生四氢嘧啶的重组大肠杆菌(E.coli Hect)，所述重组大肠杆菌是将大肠杆菌E.coli MG1655的二氨基庚二酸脱羧酶lysA基因敲出，并导入核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示四氢嘧啶合成基因簇ectABC获得的。所述二氨基庚二酸脱羧酶lysA基因核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。所述四氢嘧啶合成基因簇ectABC先与pTrc99a质粒连接，再将重组质粒导入宿主菌获得的。

本发明所述产生四氢嘧啶的重组大肠杆菌(E.coli Hect)的构建方法如下：

(1)敲出大肠杆菌E.coli MG1655的二氨基庚二酸脱羧酶lysA基因，切断L-天冬氨酸到赖氨酸支路的代谢，获得大肠杆菌E.coli MG1655-1。

(2)从伸长盐单胞菌H.elongata(CGMCC 1.6329)中克隆四氢嘧啶的合成基因簇ectABC，以pTrc99a质粒为载体导入到大肠杆菌E.coli MG1655-1，构建从L-天冬氨酸到四氢嘧啶的合成途径，基因簇ectABC分别表达氨基丁酸乙酰基转移酶、二氨基丁酸氨基转移酶和四氢嘧啶合成酶，构建得到产生四氢嘧啶的工程菌E.coli Hect。