[发明专利]一种在低氧环境中从胎盘中获取造血干细胞的方法有效

专利信息
申请号: 201810997395.5 申请日: 2018-08-29
公开(公告)号: CN108949686B 公开(公告)日: 2022-01-14
发明(设计)人: 王浩;朱丰城;龚霄翔;季夏芸 申请(专利权)人: 希瑞干细胞科技有限公司
主分类号: C12N5/0789 分类号: C12N5/0789
代理公司: 无锡市汇诚永信专利代理事务所(普通合伙) 32260 代理人: 张欢勇
地址: 214000 江苏省无锡*** 国省代码: 江苏;32
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摘要:
搜索关键词: 一种 低氧 环境 胎盘 获取 造血 干细胞 方法
【权利要求书】:

1.一种在低氧环境中从胎盘中获取造血干细胞的方法,其特征在于,包括以下步骤:

步骤1,胎盘采集:使用脐带夹夹住胎盘中的脐带末端,将胎盘立刻放入盛有足量组织保护液的无菌采样袋中,确保胎盘全部没入该组织保护液中,排除多余空气,封好无菌采样袋,立即于低温环境下运输至实验室,所述低温环境的温度要求为:2-24℃;

步骤2,胎盘预处理:在无菌低氧环境下,将胎盘从无菌采样袋中取出,用75%酒精擦拭胎盘组织表面,再用无菌生理盐水将胎盘组织上残留的组织保护液清洗干净,去除死细胞和血凝块,移除羊膜和蜕膜等组织,剪去步骤1中用脐带夹夹住的那端的部分脐带,胎盘上余留下的脐带长度为5-6cm,用无菌处理过的脐带夹夹住所述余留下的脐带末端,防止脐带血流失;

步骤3,获取脐带血:在无菌低氧环境下,松开脐带末端的脐带夹,将脐带末端放入50ml离心管中,挤压胎盘,将脐血挤到离心管中,再将脐血从离心管转移至无菌血袋中,待从中获取造血干细胞;

步骤4,胎盘灌注:在无菌低氧环境下,再次用无菌处理过的脐带夹夹住脐带末端,将灌注液1注射至脐带静脉或者动脉中,注射的同时摇晃胎盘,使得灌注液1进入胎盘血管网络,随后将脐带末端放入50ml离心管,挤压胎盘,从脐带末端流入离心管中的混合液体即为收集液1;重复此注射收集操作5-10次,直至胎盘胎儿面发白,汇集收集液1;

步骤5,胎盘再灌注:在无菌低氧环境下,将灌注液2注射入脐动脉或者脐静脉中,注射得灌注液2为20-50ml,用无菌处理过的脐带夹夹住脐带末端,再将所述胎盘放入玻璃皿中,低氧环境中,37℃孵育1h;

步骤6,脐血单个核细胞分离:在无菌低氧环境下,步骤5中在灌注液2注射入胎盘的脐动脉或者脐静脉操作时,注射的同时摇晃胎盘,使得灌注液2进入胎盘血管网络,随后将脐带末端放入离心管内,挤压胎盘,从脐带末端流入离心管中的混合液体即为收集液2;所述注射收集操作重复2次,汇集收集液2;将收集液2与步骤4中获取的收集液1混合,在200g离心力、4℃条件下,离心10min;保留沉淀,用磷酸缓冲液重悬后,形成重悬液,再加入人淋巴细胞分离液,重悬液体积与人淋巴细胞分离液体积之比为3:4-3:5,低氧环境中进行离心,在相对离心力800g,温度20℃条件下,离心20min;收集沉淀即为单个核细胞1,即为脐血单个核细胞;

步骤7,绒毛组织消化:在无菌低氧环境下,将胎盘绒毛物理分割至0.1-0.2mm3大小,300目筛网过滤组织碎块,过滤时不断添加组织保护液,去除红细胞;收集滤渣,将所述滤渣分装于离心管中,每个离心管中的滤渣体积为17-23ml,再加入消化液,其中滤渣与消化液的体积比为2:3;将离心管置于低氧环境中,37℃孵育1.5h;

步骤8,胎盘单个核细胞分离:在无菌低氧环境下,将步骤7中的滤渣与消化液的混合物,于300目筛网过滤,过滤的同时加入组织保护液,将滤液收集后离心,得到沉淀,汇集沉淀,加入组织保护液重悬,形成重悬液,再加入人淋巴细胞分离液,人淋巴细胞分离液与重悬液体积之比为4:3,在低氧环境中进行离心,在离心力800g,温度20℃条件下,离心20min,收集沉淀,即为单个核细胞2,即为胎盘单个核细胞;

步骤9,汇集单个核细胞1和单个核细胞2,形成总胎盘单个核细胞,即获得造血干细胞,

步骤1中所述组织保护液的配制方法为:100ml的容量瓶中加入1ml双抗和5mg环孢素A,加入磷酸缓冲液定容至100ml,

步骤4中所述灌注液1成分为:含有10%胎牛血清的磷酸缓冲液,

步骤4中所述灌注液2成分为:含0.15%胶原酶的磷酸缓冲液,

所述消化液成分为:每30ml消化液中包括5ml分散酶,2.5ml I型胶原酶,1ml DNA酶1,0.5ml双抗,21ml含10%胎牛血清的磷酸缓冲液,

步骤2至步骤8中的低氧环境的氧浓度均为2%。

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