[发明专利]一种在低氧环境中从胎盘中获取造血干细胞的方法

说明书

本发明涉及造血干细胞的获取方法技术领域，尤其涉及一种在低氧环境中从胎盘中获取造血干细胞的方法。本发明获取胎盘中造血干细胞的过程全部在一个模拟生物体内的正常低氧环境条件下完成；在获取造血干细胞的过程中所使用的消化液为包括胶原酶、分散酶、DNA酶1和胎牛血清的混合液。采用本发明从胎盘中获取造血干细胞的方法，克服了因短暂高氧造成的非生理氧压应激的问题，获得的造血干细胞数量多、状态原始，且在体外有良好的增殖和分化能力。

技术领域

本发明涉及造血干细胞的获取方法技术领域，尤其涉及一种在低氧环境中从胎盘中获取造血干细胞的方法。

背景技术

造血干细胞(hematopoietic stem cells，HSC)是一小群具有高度自我更新和多向分化潜能的造血前体细胞。目前已证实HSC至少能够分化成12个系列的血细胞及其它细胞，包括红细胞、粒细胞、单核细胞、嗜酸粒细胞、嗜碱粒细胞、肥大细胞、血小板、淋巴总细胞、B淋巴细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞，以及骨髓中的成骨细胞及成纤维细胞。造血干细胞移植是治疗恶性血液性疾病和某些免疫疾病的重要手段。一般造血干细胞来源于骨髓、脐带血。

异体骨髓造血干细胞移植存在较高的致死率和致残率，需要HLA抗原配型，但很难找到合适配型，且配型过程漫长、复杂、移植后需要使用昂贵的免疫抑制剂、存在较高近远期排斥反应，取材困难，易被供者拒绝。胎盘和脐带血都是产后废弃物，对产妇和胎儿无任何损害。寻找HLA相合脐带血所需时间短，可根据患者需要及时进行移植，且免疫细胞不成熟，移植后急、慢性移植物抗宿主病(GVHD)的发生率低且严重程度较轻。但脐带血只能收集来自于脐带的血液，由于其细胞数量有限，用于成人移植有一定的限制，只能应用于儿童。胎盘为产后废弃物，而胎盘内含有多种可参与细胞、组织甚至器官修复的干细胞，其中就含有大量HSC。胎盘来源HSC具有以下几个优点：首先，作为医疗废物，易于获取，无伦理问题；其次，胎盘中HSC数量较大，研究表明胎盘中造血干细胞表面标志分子CD34+数量是脐血10倍。胎盘来源HSC较脐血来源HSC更为原始，含有大量表型为CD133+CD34-的不成熟造血干/祖细胞(HSPC)，该细胞群是CD34+细胞以及血管内皮组织的的祖细胞。由此可见，足量的、高活性的胎盘来源造血干细胞有望成为基础研究和临床造血干细胞移植的新来源。

无论是骨髓、脐带血还是胎盘，造血干细胞在体内所处的位置都是属于低氧环境(如图1，图中数据来自英国基尔大学干细胞生物学副教授，Nicholas R.Forsyth PhD)。然而，到目前为止，几乎所有的造血干细胞研究结果都是基于非生理条件下的氧分压，即常氧，而常氧环境下获取的干细胞数量往往被低估。近年来有研究发现，通过将造血干细胞的相关实验操作放置于低氧条件下进行，即便细胞短暂暴露于常氧环境中，也会导致长时程造血干细胞的数目大量减少，这种现象被为非生理氧压应激(EPHOSS，extraphysiologicoxygen shock/stress)。

发明内容

本发明是为了解决上述问题而进行的，目的在于提供一种在进行体外获取胎盘造血干细胞过程中，在一个模拟生物体内的正常低氧环境条件下，克服因短暂高氧造成的非生理氧压应激，获得数量多、状态原始、增殖能力强的造血干细胞的方法。

本发明提供了一种在低氧环境中从胎盘中获取造血干细胞的方法，包括以下步骤：

步骤1，胎盘采集：使用脐带夹夹住胎盘中的脐带末端，将胎盘立刻放入盛有足量组织保护液的无菌采样袋中，确保胎盘全部没入该组织保护液中，排除多余空气，封好无菌采样袋，立即于低温环境下运输至实验室，所述低温环境的温度要求为：2-24℃；

步骤2，胎盘预处理：在无菌低氧环境下，将胎盘从无菌采样袋中取出，用75％酒精擦拭胎盘组织表面，再用无菌生理盐水将胎盘组织上残留的组织保护液清洗干净，去除死细胞和血凝块，移除羊膜和蜕膜等组织，剪去步骤1中用脐带夹夹住的那端的部分脐带，胎盘上余留下的脐带长度为5-6cm，用无菌处理过的脐带夹夹住所述余留下的脐带末端，防止脐带血流失；