[发明专利]一种具有核酸洗脱功能的反转录PCR反应液和核酸提取方法

说明书

本发明公开了一种具有核酸洗脱功能的反转录PCR反应液，其组分包括两种方案：其一包括双功能聚合酶，dNTPs，引物，探针，氯化锰或醋酸锰，Bicine/KOH，醋酸钾和甘油；其二包括耐热反转录酶mlv，dNTPs，引物，探针，KCl和Tris‑HCl；pH≥8.0。本发明配制了一种具有核酸洗脱功能的反转录PCR反应液，该反应液可耐受50‑95℃高温，采用该反转录PCR反应液替代了原经典检测方法中的PCR反应液和洗脱液，即将原PCR反应液和洗脱液合成为一个试剂‑‑‑反转录PCR反应液，同时可将洗脱步骤与后续PCR体系构建步骤合并，简化了一个步骤，该步骤的缩减对于自动化尤其是核酸POCT的实现非常关键。

技术领域

本发明涉及PCR扩增技术领域，尤其是涉及一种具有核酸洗脱功能的反转录PCR反应液，本发明还涉及使用该反转录PCR反应液进行核酸提取的方法。

背景技术

核酸检测过程包括核酸提取和PCR扩增检测。经典的检测步骤包括：裂解吸附，洗涤，洗脱，洗脱物加入PCR体系，加入PCR试剂，混合后进行检测。由于洗脱过程往往需要在高温（50-95℃）下进行，而高温会对反转录酶的活性造成影响，降低了反转录效果。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有核酸洗脱功能的反转录PCR反应液，解决了高温洗脱对反转录酶活性的影响；本发明同时还提供采用该反转录PCR反应液进行核酸提取的方法。

为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：

方案1：本发明所述的具有核酸洗脱功能的反转录PCR反应液，包括以下组分：2-100U双功能聚合酶，50-400μM dNTPs，50-400nM引物，20-400mM探针，2-10mM 氯化锰或醋酸锰，10-100mM Bicine/KOH，20-200mM醋酸钾，5-10%甘油；其pH≥8.0。

方案2：本发明所述的具有核酸洗脱功能的反转录PCR反应液，包括以下组分：2-100U耐热反转录酶mlv，50-400μM dNTPs，50-400nM引物，20-400mM探针，10-100mM KCl，20-200mM Tris-HCl；其pH≥8.0。

本发明方案1或方案2中还可以包括PCR增强剂。

本发明所述的一种核酸检测方法，包括磁珠法核酸提取和PCR扩增，所述磁珠法核酸提取用的洗脱液和PCR扩增用的PCR反应液合成为按方案1或方案2配制的一种试剂----反转录PCR反应液；这样即可将洗脱步骤与后续PCR体系构建步骤合并为一个步骤。

本发明的优点在于配制了一种具有核酸洗脱功能的反转录PCR反应液，该反应液可耐受50-95℃高温，采用该反转录PCR反应液替代了原经典检测方法中的PCR反应液和洗脱液，即将原PCR反应液和洗脱液合成为一个试剂---反转录PCR反应液，同时可将洗脱步骤与后续PCR体系构建步骤合并，简化了一个步骤，该步骤的缩减对于自动化尤其是核酸POCT的实现非常关键。

本发明将反转录酶采用耐高温的Tth酶或耐热的mlv聚合酶，解决了高温洗脱对反转录酶活性的影响。利用pH 8.0以上的高pH条件和60-90℃高温实现核酸的洗脱，同时高温洗脱，促进了RNA的解链，恢复低温后，促进了引物与RNA模板的结合，更有效的提高了反转录效果。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明做更加详细的说明。如无特殊说明，本发明中采用的方法均为本领域的常规方法，所用的检验设备或试剂均为市售产品。

实施例1 配制一种具有核酸洗脱功能的反转录PCR反应液（方案1，采用双功能聚合酶）