[发明专利]VPS10基因在酿酒酵母菌株低分泌蛋白A中的应用

说明书

本发明提供了一种VPS10基因在酿酒酵母菌株低分泌蛋白A中的应用，是通过过表达控制蛋白酶A从高尔基体向液泡分选的受体基因VPS10来实现的。过表达VPS10的菌株，胞内酶活提高了1.47倍，而胞外酶活降低到出发菌株的61％，同时过表达菌株的发酵特性并没有明显改变。本发明为降低蛋白酶A胞外酶活的同时不改变发酵特性提供了一种的新的思路和方法，对提高工业酵母泡沫稳定性具有指导意义。

本申请为中国发明专利申请2014107202377的分案申请，原申请的申请日为2014年12月2日，发明名称为：一株胁迫条件下低蛋白酶A外泌的酵母菌株。

技术领域：

本发明属于生物工程技术领域，涉及工业微生物的育种，特别是VPS10基因在发酵末期胁迫条件下适合低蛋白酶A外泌的酵母菌株中的应用。

背景技术：

在纯生啤酒发展的过程中，一些有关纯生啤酒的质量问题一直困扰着酿造工程师，其中纯生啤酒的泡沫稳定性问题尤为突出。由于纯生啤酒在包装前未经过巴氏灭菌，在发酵末期，氮源不足，高的酒精和二氧化碳浓度会给酵母造成一个胁迫环境，导致蛋白酶A的外泌，分解泡沫阳性蛋白，降低啤酒泡持性，对纯生啤酒的泡沫质量产生不利影响。因此，提高纯生啤酒的泡沫稳定性，成为当今世界改善纯生啤酒质量的一个重大技术难题。

虽然，通过优化发酵工艺，或者添加泡沫稳定剂能够从一定程度上改善啤酒泡沫稳定性，但是这种方法都不能从源头上解决泡沫衰减问题。基因工程上通过敲除产生蛋白酶A的基因PEP4来降低蛋白酶A外泌，从而使啤酒的稳定性增加。但是，由于胞内蛋白酶A对酿酒酵母细胞的生理生化功能有很重要的作用，例如参与液泡内多种酶的成熟和激活过程；影响细胞内一些糖代谢酶的正常表达等。所以PEP4缺失菌株的发酵特性会受到胞内蛋白酶A缺失的影响。

正常代谢条件下酿酒酵母蛋白酶A的分泌过程是，前蛋白酶A原(preproPrA)在粗面内质网合成后，先经过内质网的修饰和折叠，再运输到高尔基体，最终被液泡分选受体定向运输至液泡并在液泡中形成成熟的蛋白酶A(PrA)。但是随着发酵后期各种营养物质缺乏、氮源不足等胁迫条件下就会错误地运送到胞外，并在胞外被激活。

正常代谢条件下，VPS10作为编码液泡分选受体的基因，在蛋白酶A从高尔基体向液泡定向分泌的过程中起着重要作用。当蛋白酶A原前肽上的识别位点与分选受体特异性结合，蛋白酶A原从反面高尔基体网络被输送至液泡，并在到达液泡后被激活，由54个氨基酸残基组成的前肽被切除，最后形成分子量约42kD活性蛋白酶A。

然而，目前对于在胁迫条件下，通过调控液泡分选受体的表达量来控制蛋白酶A的内外分泌的研究报道很少，尤其是在选育低蛋白酶A外泌的酵母菌株的研究方面更是空白，因此，本发明通过设置一个氮源缺乏，并且高的酒精和二氧化碳浓度的胁迫环境，来模拟啤酒发酵后期的发酵条件，分别敲除和过表达VPS10基因，来调控液泡受体表达量，进而选育出适合发酵的低产蛋白酶A菌株，这种方法对于提高啤酒泡沫稳定性，尤其是纯生啤酒的泡沫稳定性具有指导意义。

发明内容：

本发明所述的调控蛋白酶A胞内外分泌的新方法是通过过表达酿酒酵母出发菌株中编码液泡分选受体的VPS10基因全序列，获得低蛋白酶A酿酒酵母菌株。

所述VPS10基因其Gene ID为：852264，核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。

优选的，所述酿酒酵母出发菌株为模式菌株W303-1A；

所述低蛋白酶A分泌的酿酒酵母菌株的构建方法，包括如下步骤：

(1)先将pPGK1质粒上的强启动子PGK1p-PGK1t片段插入到YEP352表达载体上，再将VPS10基因插入到启动子PGK1p和终止子PGK1T之间，最后将KanMX抗性标记插入表达质粒。

(2)将重组表达质粒导入到出发菌株中,得到过表达VPS10的重组菌株WGV10。

具体如下：