[发明专利]一种氧化修饰的含氮碱基的检测方法

说明书

本发明涉及DNA修饰检测领域，具体而言，涉及一种氧化修饰的含氮碱基的检测方法，本发明所述的氧化修饰的含氮碱基的检测方法测定不同含氮碱基的IPD值，根据IPD值的不同得到氧化修饰的含氮碱基。本发明人发现，氧化修饰的含氮碱基与未修饰的含氮碱基的IPD(脉冲间隔时间)值不同，据此，可区分含氮碱基是否进行了修饰。

技术领域

本发明涉及DNA修饰检测领域，具体而言，涉及一种氧化修饰 的含氮碱基的检测方法。

背景技术

DNA存储着生物体赖以生存和繁衍的遗传信息，当受到外界环 境和生物体内部的因素影响时，会导致DNA分子的损伤或改变。自 由基是一类高活性的物质，能够直接或间接的发挥强氧化的作用。活 性氧(Reactive oxygen species，ROS)常见的形式包括羟自由基(·OH)、 超氧阴离子(O^2-·)及过氧化氢(H₂O₂)等，含有即为活泼的单电子， 极易与亲核性的DNA分子结合，导致DNA碱基的修饰改变。其中， 鸟嘌呤C8位的氧化(形成8-羟基脱氧鸟嘌呤，8-oxoG)是由活性氧 引发的最常见的DNA氧化修饰之一，具有体内生成量较高、普遍且稳定的特点。8-oxoG修饰可引起DNA复制时碱基的错误配对及编码， 从而导致基因突变，具有诱发基因突变、致癌的潜在风险。DNA损 伤与肿瘤、衰老以及免疫性疾病等多种疾病的发生有着密切的联系。 因此，作为DNA氧化损伤的生物标志物，对8-oxoG含量的检测对 于疾病的早期检测和监控有着重要的意义。

8-oxoG是DNA氧化修饰的特异产物，是公认的外源以及內源因 素对DNA氧化损伤的生物标志物。当生物体内的修复机制正常时，8-oxoG能够在DNA糖基化酶，如8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶OGG1 的作用下从DNA链上切除，同时掺入正常的鸟嘌呤碱基。DNA中 8-oxoG的检测方法主要有酶联免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)、32P后标记法和高效液相色谱-电化 学检测法(High Performance Liquid Chromatography-Electrochemical Detection，HPLC-ECD)等。这几种方法都具有检测灵敏度高的特点， 但是其测定的都是DNA中全部氧化产物的量或者是组织中8-oxoG 的总含量，并不能确定8-oxoG修饰在基因组DNA中发生损伤的具 体位点。而确定基因组上易发生8-oxoG修饰的区域位置及基因偏好 性对于疾病的预防及精准治疗意义非凡。

随着测序技术的不断发展，第三代测序技术，即单分子实时测序 (SingleMolecule Real Time，SMRT)技术在基因组DNA、转录组、 甲基化修饰等表观遗传学、靶向测序等方面已应用的十分广泛。SMRT 技术能够实现真正单分子测序，即测序过程无需进行PCR扩增，可 轻松覆盖高GC和高重复区域，对低丰度/低频突变定量更准。目前， 基于SMRT测序技术的PacBio Sequel测序仪具有超长的读长，平均 读长可达到8～12Kb，数据产出可达到4～7Gb/SMRT Cell，并且可以 利用测序过程中聚合酶反应的动力学变化，直接检测碱基的修饰情况， 从而统一分析基因组学和表观遗传学数据。

鉴于此，针对DNA氧化损伤在疾病预防和治疗中的重要性，有 必要提供一种能够确定8-oxoG在基因组DNA上发生氧化修饰的位 点的新方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种氧化修饰的含氮碱基的检测方法，特 别提供一种8oxoG修饰位点分析法，基于SMRT测序技术对DNA序 列中发生8-oxoG修饰的位点进行确认，实现对DNA中氧化修饰的 位点鉴定和分析的方法。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种氧化修饰的含氮碱基的检测方法，测定不同含氮碱基的IPD 值，根据IPD值的不同得到氧化修饰的含氮碱基。