[发明专利]一种诺丽自然发酵过程中关键微生物甄别及筛选的方法

权利要求书

1.一种诺丽自然发酵过程中关键微生物甄别及筛选的方法，其特征在于，所述诺丽自然发酵过程中关键微生物甄别及筛选的方法以诺丽发酵过程的发酵汁中微生物为对象，液氮冻融破壁后，以CTAB法提取发酵汁中细菌的宏基因组DNA并纯化；PCR扩增16S rDNA序列后，应用高通量测序完成细菌可变区序列的读取，利用生物信息学平台对序列进行质控并完成物种注释，从微生物种的水平上确定诺丽自然发酵过程中起关键作用的微生物物种。

2.如权利要求1所述的诺丽自然发酵过程中关键微生物甄别及筛选的方法，其特征在于，所述诺丽自然发酵过程中关键微生物甄别及筛选的方法包括以下步骤：

步骤一，从诺丽发酵汁富集微生物，应用液氮冻融的方法获取细菌宏基因组DNA并纯化；

步骤二，PCR扩增，以细菌16S rDNA V3-V4区为目的片段，应用通用引物完成该区片段的扩增和纯化；

步骤三，应用基于二代测序原理的高通量测序仪完成扩增片段的序列读取；

步骤四，通过生物信息学平台对测定序列进行解读，完成微生物物种的注释，同时应用统计学方法甄别在诺丽发酵过程中起关键作用的微生物物种；

步骤五，利用MRS选择性培养基对甄别出的关键微生物进行筛选。

3.如权利要求2所述的诺丽自然发酵过程中关键微生物甄别及筛选的方法，其特征在于，所述步骤一具体包括：在提取前增加液氮冻融加陶瓷珠击打破碎方式释放细胞内容物，再应用CTAB法提取，获取DNA后用琼脂糖凝胶电泳和微量紫外分光光度计检测DNA质量。

4.如权利要求2所述的诺丽自然发酵过程中关键微生物甄别及筛选的方法，其特征在于，所述步骤二具体包括：

1)样本特异性条形码引物的设计：运用引物设计软件，设计样本V3-V4可变区特异性条形码高通量测序引物；

2)细菌16S rDNA V3-V4区扩增：以上述微生物宏基因组DNA为模板，用上述设计的样本特异性条形码高通量测序引物进行PCR扩增。

5.如权利要求2所述的诺丽自然发酵过程中关键微生物甄别及筛选的方法，其特征在于，所述步骤三具体包括：PCR产物经电泳检测和定量后，应用二代高通量测序平台对样品进行桥式PCR高通量测序，每个样品确保获得20,000条高质量序列，可覆盖样品中99％以上微生物信息的碱基序列构成。

6.如权利要求2所述的诺丽自然发酵过程中关键微生物甄别及筛选的方法，其特征在于，所述步骤四具体包括：基于生物信息学平台，对原始测序读长进行质控，去除低质量序列保留高质量序列；把选取的高质量序列与NCBI数据库中标准序列进行比对，鉴定出微生物物种；运行微生物多样性分析程序，经过选取代表性序列和与参考菌库比对后获得物种多样性信息，基于Unifrac进化距离分析样品之间的β多样性并解释不同之间时间点样品的群落构成动态变化；应用随机森林机器学习模型计算出各个菌种的权重和变化规律，甄别出发酵过程中关键微生物。

7.如权利要求2所述的诺丽自然发酵过程中关键微生物甄别及筛选的方法，其特征在于，所述步骤五具体包括：利用MRS选择性培养基对甄别出的关键微生物进行筛选。