[发明专利]一种诺丽自然发酵过程中关键微生物甄别及筛选的方法

说明书

本发明属于微生物的存在或种类的测定技术领域，公开了一种诺丽自然发酵过程中关键微生物甄别及筛选的方法，以诺丽发酵过程的发酵汁中微生物为对象，提取发酵汁中细菌的宏基因组并纯化；扩增可变区序列后，应用高通量测序完成细菌可变区序列的读取，利用生物信息学平台对序列进行质控并完成物种注释，确定诺丽自然发酵过程中起关键作用的微生物物种。本发明简便、快速、准确地定性定量甄别诺丽发酵过程中的核心微生物，检测分辨率高，能全面快速的筛选确立发酵中的优势、有“正向促进”的关键微生物菌种，为后续对诺丽“进行人工接种、有控制地自然发酵”，以缩短发酵周期，有目的的提高核心化合物的产量，确保发酵品质的稳定提供参考数据。

技术领域

本发明属于微生物的存在或种类的测定技术领域，尤其涉及一种诺丽自然发酵过程中关键微生物甄别及筛选的方法。

背景技术

目前，业内常用的现有技术是这样的：诺丽(Noni，Morinda citrifolia Linn)又称海巴戟、海巴戟天、海滨木巴戟、诺尼，属茜草科海巴戟天属药用植物。主要分布在南太平洋诸岛屿、澳大利亚、东南亚，以及我国海南岛、西沙群岛和台湾等地。其果实为多花聚合而成的聚花果，波利尼西亚人将它用作食品、药品已有约2000年历史。在各种体内和体外研究中，源自海巴戟的产品已经显示出抗血栓、降血糖，抗癌、抗菌活性，以及清除自由基，调节胆固醇，刺激免疫系统，调节细胞功能和净化血液等多种功能，对癌症、糖尿病、痛风等多种疾病有较好的预防和治疗作用。诺丽由超过227种以上的植物营养素构成：主要包括多种氨基酸、维生素、多酚类化合物(主要成分东莨菪亭)、多糖、有机酸、蛋白质、生物碱(主要成分环烯醚萜类化合物)。诺丽相关产品早在20世纪90年代已在美国商业化生产，目前投放市场的产品种类繁多，包括：发酵果汁、鲜榨汁、果粉以及果茶等，相关产品已成为欧洲和北美洲常用的功能性保健饮料，其中以发酵果汁最为畅销，保健功效也宣称最佳。诺丽发酵果汁最常见的生产方法，是基于传统波利尼西亚人的处理方法加以改良：以成熟的诺丽果实为原料，去除伤疤、腐烂等不良果，经人工或机器清洗自然风干，再将果实放入密封容器中避光自然发酵(时间2个月至一年不等)。相关研究表明：采收阶段不同，诺丽中的营养成分含量也不尽相同，完全成熟时植物化学成分含量最为丰富，发酵汁产率和营养成分也相对较高。生产过程不添加任何化学制剂，收集逐渐从果肉中自然渗出的发酵液，或以压榨、离心等方式将果汁与果肉分离，过滤后即得发酵果汁。发酵后的诺丽果汁能有效增加有益微生物体(酶、酵母和菌类等)的数量和质量，从而增强有效成分的生物活性，比原果汁具有更强的功效。传统发酵方法虽然简单易行，但是加工周期长、发酵周期难控、无法控制微生物污染、产品品质不稳定。诺丽的发酵实质上是果实自身内生菌、表面菌、环境微生物等多种微生物的相互调控、共同作用的结果，发酵果汁中菌群丰富、菌相复杂，形成了一个成分多样且具有多种功能性成分的微生态，其发酵过程不但包含微生物自身之间的相互作用，还存在着微生物与底物之间以及和底物与底物之间的相互作用。由于发酵过程参数变化复杂，故发酵过程极易受到杂菌污染。因此，以期在诺丽发酵方法上有所突破，就首先要搞清楚诺丽自然发酵过程中复杂的微生物群落结构关系，在此基础上甄别出诺丽自然发酵过程中发挥主导作用的微生物及其比例，而后通过选择培养基筛选确立发酵中的优势、有“正向促进”的关键微生物菌种(优势菌)，对诺丽果“进行人工接种、有控制地自然发酵”，以缩短发酵周期。或是先将原料灭菌后，接种纯菌或组合菌(主导发酵的关键菌群)有目的的提高核心化合物的产量，确保发酵品质的稳定。从而降低有害微生物污染的几率，缩短发酵时间，最重要的是可以保障产品维持恒定的品质，解决行业技术瓶颈、为整体提升行业技术水平奠定坚实的理论基础，为诺丽产业的健康持续发展提供技术指导，同时为进一步研究诺丽果汁发酵调控机理提供新的思路。而传统的基于纯培养的微生物群落鉴定的方法由于培养基和培养条件的限制，仅能够部分揭示微生态环境样品中的微生物多样性，无法客观系统的阐释群落构成。二代测序平台的出现和日趋成熟为微生态系统微生物群落领域的研究注入了一股新鲜的血液，伴随着第二代测序技术的飞速发展和生物信息学技术的突飞猛进，基于微生态样品生物群落结构的研究已成为可能。在已知的微生态系统中，与诺丽动态发酵过程中的微生物群落结构相比较，人类肠道菌群要复杂的多。然而即使在如此复杂的微生态系统中，基于二代测序平台的宏基因组学技术依然能够轻松应对并精确剖析。宏基因组是指特定环境中全部微生物遗传物质的总和。宏基因组学研究利用测序技术对环境样品中全部微生物的基因组进行测定，以分析微生物群体的基因组成及功能和代谢通路，解读微生物群体的多样性和丰度，探索微生物与环境及宿主之间的关系，发掘和研究新的具有特定功能的基因等。与传统方法相比，基于高通量测序的宏基因组研究无需构建克隆文库，这避免了文库构建过程中利用宿主菌对样品进行克隆而引起的系统偏差，简化了实验操作，提高了测序效率，从而极大地促进了宏基因组学的发展。因此将此技术应用于诺丽发酵过程中其发酵汁微生物群落结构的动态研究是完全可行的。