[发明专利]增强血管内皮细胞表达P选择素的方法

说明书

本发明提供了一种增强血管内皮细胞表达P选择素的方法，其中，包括以下步骤：(1)设置冲击波设备作用模式及作用参数包括：压强、频率、频次；(2)准备继代培养的血管内皮细胞或实验小鼠体内血管内皮细胞，离心后，用10％的完全培养液重悬移植到培养皿中，再利用探头对细胞进行冲击波处理；(3)完成冲击波处理后，继续培养60小时，再分离血管内皮细胞利用荧光定量PCR方法检测P‑选择素基因表达量，以GAPDH基因为参考内标。本发明通过冲击波增强血管内皮细胞的P选择素表达，不需要其他药物或化学品刺激，操作简便、效果显著，尤其是在活体内的血管内皮P选择素表达上有绝对优势，是未来干细胞归巢及干细胞相关技术的发展基础。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种增强血管内皮细胞表达P选择素的方法。

背景技术

干细胞在医学界被称为“万用细胞”，它可以分化成多种功能细胞或组织器官。干细胞移植治疗是把健康的干细胞移植到患者体内，以达到修复或替换受损细胞或组织，从而达到治愈的目的。干细胞移植治疗范围很广，一般能治疗神经系统疾病、免疫系统疾病、还有其他的一些内外科疾病。但是干细胞移植治疗的许多技术环节没有攻克，从而明显影响了治疗的成功率，比较典型的问题是干细胞不能有效的归巢到受损部位。已经有许多研究结果表明：受损部位细胞的P-选择素(P-Selectin)是诱导干细胞归巢的关键因素之一，缺少P-选择素，干细胞无法在血管内皮细胞上定位粘附。要增强干细胞在目标靶部位的富集，必须有效增强P-选择素的表达，但是对于怎样简单有效的调控目的细胞的P选择素基因表达，还比较缺乏相应的技术。

发明内容

一种增强血管内皮细胞表达P选择素的方法，其中，包括以下步骤：

步骤(1)：设置冲击波设备作用模式及作用参数包括：压强、频率、频次；

步骤(2)：准备继代培养的血管内皮细胞或实验小鼠体内血管内皮细胞，离心后，用10％的完全培养液重悬移植到培养皿中，再利用探头对细胞进行冲击波处理；

步骤(3)：完成冲击波处理后，继续培养60小时，再分离血管内皮细胞利用荧光定量PCR方法检测P-选择素基因表达量，以GAPDH基因为参考内标。

优选的是，步骤(2)中，所述的继代培养的血管内皮细胞制备方法为：从液氮中取出原代人心脏微血管内皮细胞冻存管，37℃水浴箱融化，传至已左旋多聚赖氨酸包被的培养瓶中，放入一定适量的内皮细胞培养基，在37℃、5％二氧化碳培养箱中培养，2～3d换液，4～5d传代1次，用胰酶消化细胞，实验采用第5代细胞。

优选的是，所述原代人心脏微血管内皮细胞能够选用活体内的血管内皮细胞。

在上述任一方案中优选的是，步骤(1)中，所述的冲击波参数范围为压力1.5-3.0bar、频率8-12Hz、频次为200次。

在上述任一方案中优选的是，步骤(3)中，采用相对定量的方法对选择素基因表达水平进行计算，采用目的基因与内参基因之间Ct值之间的差异来确定目的基因的表达量，以GAPDH作为内参基因，每个RNA样品的定量PCR进行三个重复以消除系统误差。

在上述任一方案中优选的是，步骤(3)中，采用的荧光定量PCR方法检测为：用HighPure RNA Isolation Kit提取总RNA，采用TaqMan Reverse Transcription Rengents试剂盒将总RNA反转录为cDNA，取反转录产物cDNA模板2.5μL，按照TaqMan Gene ExpressionMaster Mix说明书进行定量PCR检测。

在上述任一方案中优选的是，步骤(3)中，所述继续培养的时间为60小时。

在上述任一方案中优选的是，所述增强血管内皮细胞表达P选择素的方法不局限于表达P选择素。