[发明专利]检测对虾虹彩病毒的RPA引物和探针、试剂盒及其方法

说明书

本发明公开了检测对虾虹彩病毒的RPA引物和探针、试剂盒及其方法；该RPA引物的核苷酸序列为：SHIV‑F：5’‑CAGATCAGAGCGCATTCGATCCCATAGGCACCGC‑3’；SHIV‑R：5’‑CGTAAGAGAACATGTGGTATCCGGTGAGTTCGGG‑3’；探针的核苷酸序列为：SHIV‑P：5’‑ATACGAATCTTCAGATCGTATTCCCGTGA‑FAM‑dT‑G‑THF‑C‑BHQ1‑dT‑GCCGATTACTTCTC‑P‑3’。本发明采用特定的RPA引物和探针组合，通过RPA技术检测对虾虹彩病毒，具有较高的灵敏度，最低检测极限可达到1fg/μL，以及较高的特异性，且出峰时间早，7min左右即可出峰，适用于对虾虹彩病毒隐性感染的早期监测。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及检测对虾虹彩病毒的RPA引物和探针、试剂盒及其方法。

背景技术

虹彩病毒(iridescent virus)属于虹彩病毒科，是一种二十面体对称的胞浆型、双链DNA病毒，该病毒的宿主很广，能够感染鱼类、两栖类和无脊椎动物。而感染该病毒会造成造血织组坏死，主要病征会出现体色变黑、鳃盖张开及鳃部出血的情况。对于该病的防治方法，国内外学者普遍认为，综合预防是相对有效的方法，即尽早发现疾病并采取诸多措施阻止病毒传播。

对虾血细胞虹彩病毒(Shrimp hemocyte iridescent virus，SHIV)，最早由Lightner和Redman于1993年在靠近厄瓜多尔的对虾养殖场中的原糙对虾(Protrachypeneprecipua Burkenroad)中被发现，病虾症状为活力较差，肝胰腺明显萎缩，肌肉发白，肠道发红、断裂，空肠空胃，鳃、步足及游泳足发黑。建立灵敏、准确、快捷、方便的SHIV病原检测方法能更有效地预防对虾虹彩病毒病的发生，进一步降低养殖风险，是减少虹彩病发生和危害的重要途径。

目前，对虾是否感染虹彩病毒的检验通常采用病理学显微镜观察、生化测定、免疫学试验、细胞培养和PCR等，这些方法耗时、耗力、操作复杂，很难适应当前快速、准确检测的需要。

近年来，分子生物学出现了一种新型的等温扩增方法-重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)技术，该技术主要依赖于3种酶：能结合单链寡核苷酸引物的重组酶、单链DNA结合蛋白和DNA聚合酶，不需要模板的热循环，可以在恒定的低温条件下反应，反应的最佳温度为37～42℃，甚至可以在室温条件下(25℃)进行反应。在该方法中，重组酶在37～42℃恒温条件下可与引物DNA紧密结合，形成酶和引物的聚合体，当引物在模板DNA上搜索到与之完全互补的序列时，在单链DNA结合蛋白的帮助下，使模板DNA解链，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链，反应产物也是以指数级增长，其反应速度快，在少于30min内可以达到指数式的增长，可摆脱高端精密的温控循环系统，非常适用于现场快速检测(point-of-care testing,POCT)。

在RPA反应体系中加入含有荧光基团的探针，利用荧光信号的积累实时监控整个RPA扩增过程，可实现对起始模板的定性及定量分析。整个反应简单快速，因为不需要高温循环，所以特别适合在有大量样品的非实验室检测场所使用。

目前，关于虾虹彩病毒的检测试剂盒的报道还较少，仅有采用RAA技术检测虾虹彩病毒的专利文献，即：申请公布号为CN107988428A发明专利申请公开了一种虾虹彩病毒(SIV)RAA恒温荧光检测方法和检测试剂盒，而采用RPA反应体系检测虾虹彩病毒的还未见报道。

虽然，上述专利申请公开了与RPA技术较为接近的RAA恒温荧光检测方法，但是灵敏度还有待进一步提高，且出峰时间也较晚，有待改善。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种用于检测对虾虹彩病毒的RPA引物和探针，该引物的灵敏度高、特异性强且出峰时间早，适用于对虾虹彩病毒隐性感染的早期监测。