[发明专利]一种全长转录因子酵母双杂交文库的构建方法

权利要求书

1.一种全长转录因子酵母双杂交文库的构建方法，其特征在于，该方法用于烟草基因组全长转录因子文库构建，该方法具体包括下述步骤：

（1）转录因子筛选及开放阅读框全长扩增引物设计

依据目的作物烟草基因组信息，筛选全长转录因子及对其对应的全长开放阅读框设计PCR扩增用引物；

全长转录因子的具体筛选原则及操作步骤如下：

第一，从基因组中预测的转录因子中去除ORF不完整的转录因子；具体操作时：利用拟南芥、水稻中已经报道的转录因子，基于同源比对，对烟草红花大金元基因组中的转录因子进行预测；根据起始密码子和终止密码子，去除ORF不完整的转录因子；

第二，筛选出至少在一种组织或其器官中表达的转录因子；具体操作时：使用Affymetrix烟草全生育期表达谱芯片，分析表达谱数据，按照表达值≥4的标准，筛选出至少在根、茎、叶和花一种组织中表达的转录因子；

第三，将高度相似的转录因子进行聚类，得到非冗余的转录因子基因集；具体操作时，利用ORTHOMCL V1.4将高度相似的转录因子进行聚类，聚类标准：--pi_cutoff90，--pmatch_cutoff 80；基于聚类结果，从中得到非冗余的转录因子基因集；

第四，设计引物，并基于基因组数据，对获得的转录因子引物进行ePCR分析，筛选产物唯一的转录因子，作为建库用转录因子；对获得的转录因子引物进行ePCR分析时，比对的条件为相似性大于等于80%，覆盖度大于等于80%；

最后，基于上述操作，最终获得全长转录因子；

（2）制备cDNA模板

提取目的作物样品的总RNA，并反转录合成第一链cDNA；

（3）PCR扩增

利用平末端DNA聚合酶进行PCR扩增，获得全长转录因子的全长开放阅读框；

（4）磷酸化处理

对步骤（3）的PCR扩增产物进行5' 端磷酸化；

（5）连接重组接头

将步骤（4）中5' 端磷酸化后的PCR扩增产物连接重组接头；

（6）构建全长转录因子的文库质粒

将步骤（5）中连接有重组接头的5' 端磷酸化PCR扩增产物与酵母双杂交载体进行重组连接，构建获得全长转录因子的文库质粒；

（7）质粒转化并构建文库

将步骤（6）中所构建全长转录因子文库质粒转化、筛选，获得全长转录因子酵母双杂交文库。

2.如权利要求1所述全长转录因子酵母双杂交文库的构建方法，其特征在于，所述步骤（6）中，所述酵母双杂交载体，采用线性化的酵母双杂交载体pGADT7。

3.如权利要求1所述全长转录因子酵母双杂交文库的构建方法，其特征在于，所述步骤（1）中，对全长开放阅读框设计对应的PCR扩增用引物时，设计原则及要求如下：

第一，基于全长转录因子CDS序列，对每个转录因子的ORF进行引物设计；

第二，引物长度应在18~28bp之间，PCR扩增时，退火温度在55~65℃之间，引物对之间最大退火温差不超过5℃，最终产物长度在200~3000bp范围内；

第三，为了保证读码框准确，在上游引物5' 末端添加1个碱基；具体添加的碱基根据引物GC含量确定，具体要求为：对于GC含量小于40%的，添加C；对于GC含量大于50%的，添加T；其他情况则随机添加C或T；下游引物携带终止密码子。

4.如权利要求3所述全长转录因子酵母双杂交文库的构建方法，其特征在于，

针对转录因子Ntab_TF180，引物序列设计为：

TF180-正向引物，5’- CATGTATCAACCAATTTCGACC -3’,

TF180-反向引物，5’- TTAACTGACTAATAGCTGCTCGCC -3’；

针对转录因子Ntab_TF593，引物序列设计为：

TF593-正向引物，5’- CATGACGGACTATAGAATACCAAC -3’,

TF593-反向引物，5’- TCATCGCGATTCAGCAAT -3’。