[发明专利]一种全长转录因子酵母双杂交文库的构建方法

说明书

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种酵母双杂交文库构建方法专利申请事宜。该方法用于烟草基因组全长转录因子文库构建，具体包括：转录因子筛选及开放阅读框全长扩增引物设计、制备cDNA模板、PCR扩增、磷酸化处理、连接重组接头、构建全长转录因子的文库质粒、质粒转化并构建文库等步骤。本申请所提供全长转录因子酵母双杂交文库构建方法，是对现有构建方法的进一步综合性改进，具有转录因子阳性筛选率高、筛选准确性高、所构建文库质量高等优点，同时由于对于相关操作步骤有所优化，因而能够节省构建时间和构建成本，因此具有较好的实用价值和推广应用意义。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种酵母双杂交文库构建方法专利申请事宜。

背景技术

转录因子（transcription factor，TF），也称反式作用因子（trans-actingelement），是一类能够特异性结合真核生物启动子区域中顺式作用元件（cis-actingelement）的蛋白质，其功能是调控基因的开启、关闭及表达量的高低，转录因子的时空表达直接决定了植物的生长发育、逆境反应和次生代谢等生理功能。另一方面，研究发现转录因子间也存在相互作用，能够相互结合形成复合体，直接结合到调控基因的启动子上，共同调控相关基因的转录水平，从而完成复杂的生理过程（Chen D, et al. Antagonistic basichelix-loop-helix/bZIP transcription factors form transcriptional modules thatintegrate light and reactive oxygen species signaling in Arabidopsis. PlantCell. 2013,25(5):1657-73）。但总体而言，转录因子间相关作用的研究报道相对较少。

酵母双杂交（yeast one hybrid，Y2H）系统是在酵母体内筛选与目的蛋白（如转录因子蛋白）相互作用的未知蛋白（如转录因子）的一种常用技术方法。主要构建过程是：构建诱饵载体（用于表达已知蛋白和DNA结合功能域融合蛋白，诱饵载体一般含有报告基因，或者构建时连接有报告基因）和cDNA文库质粒（表达cDNA与转录激活功能域融合蛋白，cDNA文库包含特定组织和生长发育时期所有蛋白的cDNA序列），将2种质粒转入酵母，若cDNA文库质粒表达的蛋白中含有与目的蛋白相互作用的蛋白，则能启动报告基因的表达，从而筛选到与目的蛋白相互作用的蛋白。利用酵母双杂交技术，可以筛选相互作用的转录因子。但是现有技术中使用酵母双杂交技术从包含所有蛋白的cDNA文库中筛选相互作用的转录因子时，主要缺陷是：筛选结果的假阳性率太高，结果准确性也很低（Mitsuda N, et al.Efficient yeast one-/two-hybrid screening using a library composed only oftranscription factors in Arabidopsis thaliana. Plant and cell physiology,2010, 51(12): 2145-2151）。