[发明专利]一种可有效抑制骨肉瘤生长的生物重组型miR34a-5p

权利要求书

1.一种含有人类来源的以运载亮氨酸（Leu）的tRNA为运载骨架的生物重组型miR34a-5p，即htRNA^Leu/miR34a-5p，其特征在于，其编码核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种如权利要求1所述的生物重组型miR34a-5p的制备方法，其特征在于，依次包括如下步骤：

1）生物重组型miR34a-5p的设计及该基因PCR的扩增：

通过RNA二级结构设计网站：http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi设计，tRNA为人类来源的运载亮氨酸（Leu）的tRNA，htRNA^Leu/miR34a-5p的碱基序列如SEQ ID NO:1所示；为表达上述重组RNA，首先设计PCR引物以扩增其对应的DNA序列，上游引物序列为：5'- TTGTAACGCTGAATTCACCAGGATGGCCGAGT GGTTAAGGCGTTGGACTGGCCAGCTGTGAGTG -3'（SEQ ID NO:2），下游引物序列为：5'-CTTTCGCTAAGGATCTGCAGTGGTACCAGGAGTGGGGTTCGA ACCCACGCGGACATATGTCCATTGGATCGGGCCAACAACGTGC -3'（SEQ ID NO:3）；

2）可表达htRNA^Leu/miR34a-5p的重组质粒pBSMrnaSeph的构建和提取：

用上述PCR获得的htRNA^Leu/miR34a-5p其相应DNA序列通过EcoRI和PstI两个酶切位点插入表达质粒pBSMrnaSeph中，形成可表达htRNA^Leu/miR34a-5p的重组pBSMrnaSeph质粒，后将其转化入DH5α感受态细胞中扩增，并提取重组质粒；重组质粒经过测序确认构建成功后，便开始将其大量转化，即利用E.coli HST08大肠杆菌体系来大量表达htRNA^Leu/miR34a-5p；

3）将表达htRNA^Leu/miR34a-5p的重组质粒pBSMrnaSeph转染至E.coli HST08体内；转染浓度为100ng/10-50μL E.coli HST08；

4）将步骤3）转染了质粒的E.coli HST08在培养基中大量增殖：转染了重组质粒的E.coli HST08的浓度为10-50μL/400mL培养液，重组质粒在E.coli HST08体内大量复制的孵育时间为12-15h；

5）对E.coli HST08总RNA进行提取，并将htRNA^Leu/miR34a-5p纯化：所述的总RNA提取方法为苯酚提取法；对htRNA^Leu/miR34a-5p的纯化采用快速蛋白质液相色谱技术进行。

3.权利要求1所述的htRNA^Leu/miR34a-5p在制备治疗骨肉瘤药物中的应用。