[发明专利]一种可有效抑制骨肉瘤生长的生物重组型miR34a-5p

说明书

本发明公开了一种可有效抑制骨肉瘤生长的生物重组型miR34a‑5p，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明将人类来源的tRNA作为运载骨架，从其碱基序列中的反密码子处，通过插入可表达成熟miR34a‑5p的碱基序列，再通过质粒将该合成结构转运到普通的E.coli体内，经过12h左右的孵育，对目的miRNA进行分离、纯化和脱盐处理，便可获得能直接使用的重组型miRNA。在保证高产率、高纯度的前提下，由于其从始至终的制备过程均是以自然界生物体为媒介，极高保真度的还原了天然miR34a‑5p在细胞内原本的生物学特性，使其相对于人工化学合成的miRNA类似物而言，更加安全、稳定和天然。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种新型的可通过生物工程方法构建、规模化生产重组型的miR34a-5p，即htRNA^Leu/miR34a-5p。

背景技术

骨肉瘤(Osteosarcoma,OS)是儿童和青少年中最常见的原发性肉瘤，男性发病率高于女性，比例约为2:1左右。从解剖学角度来讲，骨肉瘤最常见的发病部位常位于股骨远端、胫骨和肱骨的近端，且在所有患者中大约有50％至70％左右发生在膝关节周围。目前在临床上，对骨肉瘤主要的治疗手段为新辅助化疗---手术局部肿瘤组织切除---化疗药物维持的治疗方式，此治疗方案给临床患者的预后带来了巨大的改变，极大的降低了患者患肢的截肢比例，且明显的将患者五年生存率从之前的20％至30％左右提升至如今的70％以上。但是，这种治疗方式中通常所使用的化疗药物如甲氨蝶呤、阿霉素和顺铂(或异环磷酰胺)剂量均相对较高，对人体的毒副作用极大，且随着治疗的不断推进，极易降低肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，甚至可直接对化疗药物产生耐药。因此，对于骨肉瘤患者及科研工作者而言，尽早研发出新型的骨肉瘤治疗药物和治疗方案就显得十分急迫。

miR34a-5p是研究最为广泛和深入的非编码RNA之一，其在众多癌症如骨肉瘤、肺癌、前列腺癌、肝癌、乳腺癌、直肠癌、胰腺癌、肾癌、膀胱癌、皮肤癌、食管癌、子宫癌、卵巢癌、尿道癌以及淋巴系统肿瘤中的表达均低于正常水平。正常生理调节情况下，miR34a-5p在转录水平直接受到抑癌蛋白p53的调控，是目前公认的抑癌miRNA，之前已有大量的文献报道指出，miR34a-5p可直接通过调控其下游靶基因如Bcl-2、SIRT1、C-MET、CDK6、CD44以及PDGFRA等而分别调控如增殖、凋亡、周期以及炎症等相应的细胞信号通路，进而发挥出明显的抑制肿瘤作用。Tian Y及其团队通过在人骨肉瘤MG63的研究中发现，在转染miR34a-5p类似物于细胞中后，细胞内凋亡及p53相关的细胞信号通路均发生了明显的改变，并对MG63细胞的生长产生了显著的抑制效果；Wu X等人的研究表明，在人骨肉瘤MG63和Saos-2细胞之中，miR34a-5p可以将细胞增殖相关蛋白Eag1明显抑制而控制肿瘤细胞的生长；Gang L于最近的一篇报道中指出，抑制miR34a-5p在人骨肉瘤U2OS的含量，可以通过减轻细胞凋亡水平和促进细胞黏附作用而提高细胞的增殖水平，相反，当把miR34a-5p转染至U2OS细胞中后，其可通过抑制miR34a-5p的靶标基因DUSP1而将细胞停滞于G0/G1期、增加细胞内细胞凋亡水平并抑制细胞的黏附作用，最终抑制细胞的增殖和生长；Chen X及其团队的研究证实，miR34a-5p可通过抑制生存蛋白(survivin)的表达而调控人骨肉瘤U2OS和Saos-2细胞的增殖作用、细胞周期、细胞凋亡以及细胞对化疗药物的敏感性进而达到对其生长的抑制效果。