[发明专利]基于副溶血性弧菌的TDH的双重PCR检测试剂盒

说明书

本发明公开了一种基于副溶血性弧菌的TDH的双重PCR检测试剂盒；所述检测试剂盒包括序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的直接溶血素基因检测用引物对，以及序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的不耐热溶血素检测用引物对。本发明提供的双重PCR检测试剂盒，可排除杂菌干扰，替代多个副溶血性弧菌毒力基因检测，以tlh筛查样本中是否存在副溶血性弧菌、以tdh1_368筛查样本中是否存在副溶血性弧菌“大流行菌群”，从而通过一次性扩增区分副溶血性弧菌流行群与非流行群，这有助于提高常规流行株检测的灵敏性及特异性，简便有效。

技术领域

本发明涉及一种基于副溶血性弧菌的直接溶血素基因(TDH)双重PCR检测试剂盒。

背景技术

副溶血性弧菌(Vibrio Parahemolyticus，VP)如今已成是中国乃至全世界范围内尤为关注的食源性致病菌，主要是通过人类食用受该菌污染的水源及水产品而造成食物中毒，能够引发急性肠胃炎，重者可引发败血症甚至危及人的生命。在影响人类健康的同时也制约着水产品养殖业的发展。从中国食源性疾病监测网上查证的数据表明，由副溶血性弧菌引发食物中毒事件已经高过了其他类型的致病性弧菌的比例，在某些沿海城市由副溶血性弧菌引发的食物中毒现象比例高达60％以上，远远高于其他类型食源性致病菌。

随着检测技术不断进步，研究人员开始关注能够引起食物中毒或临床检出占比最高的的副溶血弧菌“大流行菌群”，并通过各种技术手段进行区分和归类，从而进一步分析流行病学情况。

如今，全世界的研究者对VP毒力因子及致病机理取得了长足的进步，通过现代生物学技术对VP毒力因子，包括黏附因子、侵袭因子、产耐热直接相关溶血素(Thermostabledirect related hemolysin，TRH)、产耐热直接溶血素(Thermostable directhemolysin，TDH)、不耐热溶血素(thermolab ile hemolysin.TLH)、尿素酶、脂多糖、外膜蛋白、蛋白酶、Ⅲ型分泌系统和摄铁系统等都有了更具体的认识。

目前用于检测副溶血弧菌的PCR体系较多。利用普通PCR方法对VP的靶基因进行检测，大部分情况下选择VP的TRH或TDH基因的保守序列，其他还有toxR基因序列、gyrB基因序列和pR72H基因序列。然而，这些PCR检测方法在实验的灵敏度、特异性、抗干扰的能力上或多或少存在局限性。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术存在的不足，提供一种基于副溶血性弧菌的直接溶血素基因(TDH)及不耐热溶血素(TLH)的双重PCR检测试剂盒。本发明根据副溶血性弧菌的流行株特征性位点(tdh1_368)和tlh基因，建立优化双重PCR检测试剂盒，首次实现国内单一指标同时检测副溶血性弧菌流行与非流行菌群。具体是以tlh筛查样本中是否存在副溶血性弧菌、以tdh中特异性位点tdh1_368设计的引物对VP“大流行菌群”检测，从而通过一次性扩增区分副溶血性弧菌流行群与非流行群，显著提高常规流行株检测的灵敏性及特异性，简便有效。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

第一方面，本发明涉及一种基于副溶血性弧菌的直接溶血素基因的双重PCR检测试剂盒，所述检测试剂盒包括序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的直接溶血素基因检测用引物对，以及序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的不耐热溶血素检测用引物对。

作为优选方案，所述检测试剂盒还包括PrimeSTAR Max DNA Polymerase预混液和无菌双蒸水。

作为优选方案，所述检测试剂盒的工作条件为：95℃预变性3min；接着进行热循环29次，过程包括95℃变性30s；62℃退火1min；72℃延伸1min；最后72℃延伸5min，12℃维持至产物检测。

作为优选方案，所述的双重PCR检测试剂盒还可鉴别水产样品中副溶血性弧菌流行菌群。