[发明专利]一种双重固定化酶及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种双重固定化酶的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）将碳纳米材料均匀分散于pH=6~9的磷酸盐缓冲溶液中，得到碳纳米材料分散液；

（2）将酶加入到pH=6~9的磷酸盐缓冲液中形成酶溶液，向酶溶液中添加修饰剂，混合均匀并发生酶修饰反应，反应结束后再向其中添加单体、交联剂，然后再在无氧条件下添加引发剂和催化剂，引发原位聚合反应，反应结束后将所得反应液纯化即得到酶纳米胶囊溶液；

（3）向步骤（1）中的碳纳米材料分散液中添加步骤（2）制备的酶纳米胶囊溶液，混匀后放入冰箱中静置，最后将混合液分离、洗涤，得到的沉淀即为双重固定化酶；

步骤（2）中所述的修饰剂为丙烯酸钠;

步骤（2）中所述的单体为苯乙烯、丙烯酰胺、丙烯酸酯类化合物、甲基丙烯酸酯类化合物、丙烯酸盐类化合物、甲基丙烯酸盐类化合物、吡咯、噻吩、吡啶中的至少一种；

步骤（2）中所述的交联剂为N-亚甲基双丙烯酰胺；

步骤（2）中所述的引发剂为过硫酸铵；

步骤（2）所述的催化剂为四甲基乙二胺。

2.根据权利要求1所述的双重固定化酶的制备方法，其特征在于：

步骤（1）中所述的碳纳米材料为石墨烯，氧化石墨烯，还原氧化石墨烯、单壁碳纳米管、多壁碳纳米管、碳纤维、碳纳米球中的一种或几种混合；

步骤（1）中所述的分散指采用搅拌或超声中的至少一种方式进行分散，

步骤（1）中所述的碳纳米材料分散液的浓度为1~10 mg/mL。

3.根据权利要求2所述的双重固定化酶的制备方法，其特征在于：

步骤（1）中所述的碳纳米材料为氧化石墨烯、还原氧化石墨烯、单壁碳纳米管中的一种或几种混合；

步骤（1）中所述的分散指采用机械搅拌并结合超声处理1~5h进行分散，其中机械搅拌的速度为100~1000 r/min，超声功率为100~200 W。

4.根据权利要求1所述的双重固定化酶的制备方法，其特征在于：

步骤（2）中所述的酶包括但不限于有机磷水解酶、脂肪酶、辣根过氧化物酶、漆酶、甲酸脱氢酶，甲醛脱氢酶，甲醇脱氢酶，葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、葡萄糖异构酶、苹果酸酶和丙氨酸脱氢酶；

步骤（2）中所述的酶溶液指浓度为1~10mg/mL的酶溶液。

5.根据权利要求1所述的双重固定化酶的制备方法，其特征在于：

步骤（2）中所述的酶、修饰剂、单体、交联剂、引发剂和催化剂的质量比为1：（0.01-0.1）：（1-10）：（0.1-1）：（0.5-1）：（1-2）；

步骤（2）中所述的酶修饰反应是指在4~30℃反应2~10h；

步骤（2）中所述的原位自由基聚合反应是指在4~30℃反应1~5h；

步骤（2）中所述的纯化是指用截留分子量为1.0~3.5kD的透析袋进行透析纯化。

6.根据权利要求1所述的双重固定化酶的制备方法，其特征在于：

步骤（3）中所述的碳纳米材料分散液和酶纳米胶囊溶液的用量满足其中酶纳米胶囊和碳纳米材料的质量比为0.5~3:1；

步骤（3）中所述的放入冰箱中静置是指在4℃的冰箱中静置0.5~24h；

步骤（3）中所述的分离指通过离心、过滤、抽滤中的一种进行分离；所述的洗涤是指用磷酸盐缓冲液洗涤3~5次。

7.一种根据权利要求1~6任一项所述的方法制备得到的双重固定化酶。

8.根据权利要求7所述的双重固定化酶在催化方面的应用。