[发明专利]一种双重固定化酶及其制备方法和应用

说明书

本发明属于固定化酶领域，公开了一种利用原位自由基聚合技术和碳纳米材料对酶进行双重固化的方法。该方法首先将碳纳米材料分散于磷酸盐缓冲溶液中得到碳纳米管分散液；再配制酶溶液，采用原位自由基聚合技术对酶分子进行修饰保护，得到酶纳米胶囊溶液；然后向碳纳米材料分散液中添加酶纳米胶囊溶液，混匀后静置；最后将混合液分离，洗涤，得到的沉淀即为双重固定化酶。这种双固定化酶体系以酶纳米胶囊为基本单元，与传统的固定化酶相比，酶分子表面修饰了一层聚合物层，因而极大的提高了酶分子的稳定性。本发明得到的双重固定化酶保留了较高的酶活力，且具有比游离酶和传统固定化酶更高的环境稳定性和重复使用性能。

技术领域

本发明属于固定化酶领域，特别涉及一种利用原位自由基聚合技术和碳纳米材料制备双重固定化酶的方法及应用。

背景技术

酶是具有催化活性和高度选择性的特殊有机物，其中大多数酶的化学本质为蛋白质。受限于蛋白质自身的特性，酶对环境的变化十分敏感，高温、高压、重金属离子以及过高或过低的pH均可能会使酶丧失活力。因而，对天然酶分子进行固定化，以提高酶的结构稳定性，使其稳定地发挥催化作用就显得很有必要。

传统的固定化酶方法主要包括物理吸附法、共价结合法、交联法和包埋法等。要获得理想的固定化酶，提高固定化酶的活力和稳定性，既要选用高效的固定化方法，又要有理想的固定化载体。作为一种理想的酶固定化载体，碳纳米材料具有稳定的物理性质和优良的生物相容性。一方面，碳纳米材料稳定的物理性质保证了其在环境中具有更稳定的结构，与壳聚糖、海藻酸盐、纤维素纳米晶、多孔淀粉等有机载体相比，其在环境中不被微生物降解，给酶提供了良好的附着载体；另一方面，对比二氧化硅、玻璃、硅藻土等无机材料，其优良的生物相容性可以最大程度的保留酶的活力而对环境的影响甚小。

原位自由基聚合技术被广泛应用于蛋白质药物的靶向输送和稳态化。该方法是在分子水平上对酶蛋白进行修饰，通过原位自由基聚合技术在酶分子表面聚合生成聚合物膜，得到酶纳米胶囊。这种聚合物膜共价锚定于酶分子的表面，可以稳定酶分子的构象，降低外界环境对酶分子的影响。

碳纳米材料特殊的结构和性能使之成为理想的酶固载材料，采用碳纳米材料固定化酶在化工生产，清洁能源开发，药物靶向输送和生物传感器制备等方面具有广泛的应用前景，然而如何进一步提高酶分子在碳材料上的固载量和稳定性是研究人员一直所面临的问题，大量的研究报道集中于选择不同的交联剂亦或是采用化学键合的方法将酶固定于碳材料上，但这些方法对于不同的碳材料和酶的固定化效果差异较大，并且得到的固定化酶活力也往往很难令人满意。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种双重固定化酶的制备方法。

本发明的另一目的在于提供上述方法制备的双重固定化酶。

本发明的另一目的在于提供上述的双重固定化酶在催化方面的应用。

本发明的目的通过下述方案实现：

一种双重固定化酶的制备方法，主要包括以下步骤：

(1)将碳纳米材料均匀分散于pH＝6～9的磷酸盐缓冲溶液中，得到碳纳米材料分散液；

(2)将酶加入到pH＝6～9的磷酸盐缓冲液中形成酶溶液，向酶溶液中添加修饰剂，混合均匀并发生酶修饰反应，反应结束后再向其中添加单体、交联剂，然后再在无氧条件下添加引发剂和催化剂，引发原位聚合反应，反应结束后将所得反应液纯化即得到酶纳米胶囊溶液；

(3)向步骤(1)中的碳纳米材料分散液中添加步骤(2)制备的酶纳米胶囊溶液，混匀后放入冰箱中静置，最后将混合液分离、洗涤，得到的沉淀即为双重固定化酶。

步骤(1)中所述的碳纳米材料优选为石墨烯，氧化石墨烯，还原氧化石墨烯、单壁碳纳米管、多壁碳纳米管、碳纤维、碳纳米球中的一种或几种混合，优选为氧化石墨烯、还原氧化石墨烯、单壁碳纳米管中的一种或几种混合；