[发明专利]一种检测RCA产物的方法及应用

说明书

本发明涉及一种检测RCA产物的方法及应用，具体地，涉及一种检测滚环扩增产物的方法及筛选DNA聚合酶的方法，所述方法包括如下步骤：(1)以环状DNA分子为模板，经过滚环扩增，获得RCA产物；(2)采用粒径分析仪对所述RCA产物进行检测，获得粒径分析结果。本发明方法可以直接用于分析RCA产物的粒径，所述方法具有快速、准确且操作简便等优点，所述方法可用于优化RCA体系中的组分，从而提高RCA产物的均一性，此外，本发明方法还可以用于筛选DNA聚合酶。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，涉及一种检测RCA产物的方法及应用，具体地，涉及一种检测滚环扩增产物的方法及筛选DNA聚合酶的方法。

背景技术

滚环扩增(RCA)或多重链置换扩增(MDA)具有快速、准确、所需模板量少等特点，目前已成为生物医学技术和生物纳米技术领域重要的研究手段。Phi29是一种具有链置换能力的DNA聚合酶，已经广泛应用于RCA和MDA。然而，RCA或MDA并不像PCR反应那样，可以通过控制循环数来控制扩增产物的拷贝数。这主要是因为：(1)模板本身具有不同特征，如不同的碱基含量，poly结构等，将导致phi29在扩增中对于不同的模板产生不一样的扩增效率；(2)phi29酶是一种稳定性较低的酶，随反应时间的延长，活性会逐渐下降，因而难以较准确地评估，一定时间内RCA/MDA产物的拷贝数目。基于上述两点，RCA和MDA的产物往往均一性不够，严重影响了这两种技术的应用。

现有的检测RCA或MDA产物方法主要通过电泳，如琼脂糖电泳和脉冲电泳。但RCA产物普遍分子量较大，应用琼脂糖电泳时，大分子产物容易堆积在点样孔处，导致电泳失败。应用脉冲电泳虽然解决了产物滞留点样孔的缺点，但其存在操作复杂、耗时长的劣势。此外，电泳技术对RCA产物大小的定量较为粗糙，对于精确研究RCA产物均一性的意义不大。不仅如此，也有通过荧光定量PCR的技术来检测RCA产物的拷贝数，这种方法虽然可以做到定量，但是此方法是基于确定模板或是将RCA产物当成一个整体来检测的，对于复杂模板的扩增没有指导意义。

RCA产物是一种多拷贝的单链DNA序列，因内部DNA序列的碱基间的相互作用力，可以形成类似“球形“结构。片段化的基因组DNA加上接头序列，并环化形成单链环状DNA，随后使用滚环扩增技术可将单链环状DNA扩增多个数量级，所产生的扩增产物称为DNA纳米球(DNA nano ball,DNB)。由此可知，DNB实质上是一种典型的RCA产物，具有RCA产物的特征。因模板DNA碱基序列的差异，phi29聚合酶活性差异及反应条件的不同，RCA产物通常会表现出不同的大小甚至形态特征。因RCA产物是分子量巨大的单链DNA序列，传统的检测方法，如凝胶电泳法，及qubit定量分析仪，难以分辨不同RCA产物的大小，及一个反应体系中产物的大小分布。纳米粒径分析仪采用的是动态散射技术，根据不同粒径纳米颗粒的布朗运动状态的不同，依托现有的纳米颗粒粒径检测设备和配套的荧光信号处理软件，定量纳米颗粒的大小。而对于并不是纳米颗粒特征的RCA产物是否可以采用粒径分析仪进行检测和区分，目前为止仍未有相关的报道。

因此，有必要开发一种快速准确地检测RCA产物的方法，方便有效地优化RCA反应体系。

发明内容

针对目前检测RCA产物的手段有限，检测方法操作复杂、准确性低、耗时长的问题，本发明提供了一种检测RCA产物的方法和应用，所述方法配合荧光信号处理软件，可以直接分析RCA产物的粒径，评价RCA产物的均一性，具有快速、准确且操作简便等优点。

为达此目的，本发明采用了以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种检测RCA产物的方法，包括如下步骤：

(1)以环状DNA分子为模板，经过滚环扩增，获得RCA产物；

(2)采用粒径分析仪对所述RCA产物进行检测，获得粒径分析结果。