[发明专利]一种适用于谷氨酸棒杆菌的重组表达载体、外源蛋白表达系统、应用和木聚糖酶的制备方法

权利要求书

1.一种适用于谷氨酸棒杆菌的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体中外源蛋白基因的启动子为cspB启动子、信号肽为cspB信号肽，所述cspB启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，cspB信号肽的编码核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

2.如权利要求1所述的一种适用于谷氨酸棒杆菌的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体的外源蛋白基因下游添加有组氨酸标签。

3.如权利要求2所述的一种适用于谷氨酸棒杆菌的重组表达载体，其特征在于：所述外源蛋白基因为木聚糖酶基因，所述重组表达载体的载体骨架为pxmj19质粒。

4.如权利要求3所述的一种适用于谷氨酸棒杆菌的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

5.外源蛋白表达系统，其包括谷氨酸棒杆菌，所述谷氨酸棒杆菌转入有如权利要求1~4中任一所述的重组表达载体。

6.如权利要求1~4中任一所述的载体在谷氨酸棒杆菌中分泌表达木聚糖酶的应用。

7.木聚糖酶的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

（1）获取木聚糖酶基因，所述的木聚糖酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

（2）在所述的木聚糖酶基因下游添加组氨酸标签，获得改造后的木聚糖酶基因；

（3）将改造后的木聚糖酶基因和cspB启动子和信号肽连接到载体pxmj19上，获得重组表达载体pxmj19-cspB-cspB-xynA，所述载体pxmj19的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述cspB启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，cspB信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；

（4）将所述重组表达载体pxmj19-cspB-cspB-xynA转入谷氨酸棒杆菌，获得重组菌；

（5）培养所述重组菌，分泌表达木聚糖酶；

（6）木聚糖酶的纯化，包括：

a、将重组菌的培养物进行离心，获得含有木聚糖酶的上清；

b、将所述含有木聚糖酶的上清进行亲和层析，介质为镍柱，获得含有木聚糖酶的洗脱液；

c、将所述含有木聚糖酶的洗脱液进行脱盐，获得纯化的木聚糖酶溶液。

8.根据权利要求7中所述的木聚糖酶的制备方法，其特征在于：所述重组表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

9.根据权利要求7中所述的木聚糖酶的制备方法，其特征在于：步骤（6）中，亲和层析中用的平衡、上样的缓冲液A为：300 mMNaCl，20 mMTris，pH 8.0的缓冲液，用于洗脱的缓冲液B为：300 mMNaCl，20 mMTris，250 mM咪唑，pH 8.0的缓冲液。

10.根据权利要求7所述的木聚糖酶的制备方法，其特征在于，步骤（6）中，所述脱盐的介质为脱盐柱。