[发明专利]一种适用于谷氨酸棒杆菌的重组表达载体、外源蛋白表达系统、应用和木聚糖酶的制备方法

说明书

本发明提供了一种适用于谷氨酸棒杆菌的重组表达载体，该表达载体适用于在谷氨酸棒杆菌中表达外源蛋白并具有较高的表达水平。一种适用于谷氨酸棒杆菌的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体中外源蛋白基因的启动子为∆cspB启动子、信号肽为∆cspB信号肽，所述∆cspB启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，∆cspB信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。本发明中的外源蛋白在表达过程中，在信号肽的引导下，表达的外源蛋白能分泌到胞外，不需要经过菌体破碎，分泌出的外源蛋白相对于胞内表达易于纯化；且无胞外蛋白酶，分泌出的外源蛋白在培养基中较为稳定。此外，本发明还提供了外源蛋白的外源蛋白表达系统、应用和外源蛋白的制备方法。

技术领域

本发明涉及一种适用于谷氨酸棒杆菌的重组表达载体、外源蛋白表达系统、应用和木聚糖酶的制备方法，属于生物技术领域。

背景技术

谷氨酸棒杆菌是一种高GC含量的革兰氏阳性菌，广泛用于工业规模生产氨基酸，如谷氨酸和有机酸等。近年来，除作为氨基酸的生产之外，谷氨酸棒杆菌还被用来作为外源蛋白表达宿主。已经成功用谷氨酸棒杆菌表达出的蛋白有Fab，scFv和vhh等。相对于常用来表达外源蛋白的大肠杆菌来说，由于谷氨酸棒杆菌是一种GRAS（Generally Recognized AsSafe）菌，无内毒素并且其细胞膜为单层，外源蛋白易于分泌到胞外，不需要经过破碎，而胞内表达需要破碎，纯化前处理成本较高；较少在胞外检测到蛋白酶存在，所以分泌到胞外的蛋白较为稳定。

因此，有必要对现有载体中的关键元件，例如外源蛋白基因相应的启动子、信号肽，进行设计，使得外源蛋白在谷氨酸棒杆菌中表达并具有较高的表达水平。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种适用于谷氨酸棒杆菌的重组表达载体，该表达载体适用于在谷氨酸棒杆菌中表达外源蛋白并具有较高的表达水平。

其技术方案是这样的，一种适用于谷氨酸棒杆菌的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体中外源蛋白基因的启动子为cspB启动子、信号肽为cspB信号肽，所述cspB启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，cspB信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

进一步的，所述重组表达载体的外源蛋白基因下游添加有组氨酸标签。

进一步的，所述外源蛋白基因为木聚糖酶基因，所述重组表达载体的载体骨架为pxmj19质粒。

进一步的，所述重组表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

本发明还提供了外源蛋白表达系统，其包括谷氨酸棒杆菌，所述谷氨酸棒杆菌转入有上述任一所述的重组表达载体。

本发明还提供了上述重组表达载体在谷氨酸棒杆菌中分泌表达木聚糖酶的应用。

本发明还提供了木聚糖酶的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

（1）获取木聚糖酶基因，所述的木聚糖酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

（2）在所述的木聚糖酶基因下游添加组氨酸标签，获得改造后的木聚糖酶基因；

（3）将改造后的木聚糖酶基因和cspB启动子和信号肽连接到载体pxmj19上，获得重组表达载体pxmj19-∆cspB-∆cspB-xynA，所述载体pxmj19的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述cspB启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，cspB信号肽的核苷酸序列如SEQID NO：4所示；

（4）将所述重组表达载体pxmj19-cspB-cspB-xynA转入谷氨酸棒杆菌，获得重组菌；

（5）培养所述重组菌，分泌表达木聚糖酶；

（6）木聚糖酶的纯化，包括：