[发明专利]一种从空气中筛选产葡萄糖氧化酶菌种的方法

说明书

本发明涉及一种从空气中筛选产葡萄糖氧化酶菌种的方法。本发明人摈弃了传统的水样或土样菌种筛选方法，直接从空气中筛选目标菌种，优化了用于初筛的培养基配方以及筛选工艺，省去了初筛培养基的灭菌以及无菌操作，实现了从空气中简便、快速、精准、高效的筛选产葡萄糖氧化酶菌种。

技术领域

本发明属于微生物学领域，涉及一种产葡萄糖氧化酶菌株，具体来说是一种从空气中筛选产葡萄糖氧化酶菌种的方法。

背景技术

葡萄糖氧化酶有着广泛的商业应用价值，它广泛应用于食品、医药、饲料等各大领域。葡萄糖氧化酶的生产有植物或动物组织来源的直接提取法和微生物发酵法，由于微生物繁殖快，且易于培养，所以目前葡萄糖氧化酶的工业化生产都采用微生物发酵法。目前葡萄糖氧化酶的生产菌种主要是青霉和黑曲霉，但是产酶能力都不高。因此，筛选一株产葡萄糖氧化酶能力高的菌株是当前亟待解决的问题。目前葡萄糖氧化酶产生菌的初筛主要采用显色法，其原理为：目标菌分泌葡萄糖氧化酶到胞外，催化平皿中葡萄糖生成葡萄糖酸，同时消耗氧气生成过氧化氢，过氧化氢氧化培养基中的碘离子成单质碘，培养基中淀粉遇碘显蓝色，菌落周围蓝色圈越大，说明菌的产酶能力越强。该方法简单直观，属于微生物菌种筛选中常用的显色筛选法。葡萄糖氧化酶活力的测定常采用滴定法，其原理为：葡萄糖氧化酶是一种需氧脱氢酶，能催化葡萄糖生成葡萄糖酸。用过量的氢氧化钠中和产生的葡萄糖酸，再用盐酸返滴定，即可求得葡萄糖酸的产量，根据产葡萄糖酸量表示酶活力高低。

目前葡萄糖氧化酶产生菌的筛选大多是从水和土壤中采样筛选，本发明人直接从空气中筛选目标菌种，优化了用于初筛的培养基配方以及筛选工艺，省去了初筛培养基的灭菌以及无菌操作，实现了从空气中简便、快速、精准、高效的筛选产葡萄糖氧化酶菌种。

发明内容

本发明的目的是提供一种从空气中直接筛选产葡萄糖氧化酶菌种的方法，该方法不但省去了常规菌种筛选过程中繁琐的样品处理过程，而且筛选培养基无需灭菌，初筛过程也不需无菌操作，操作简单，成本低廉，有利于葡萄糖氧化酶菌种资源的开发。

为实现发明目的采用如下技术方案，具体操作步骤如下：

1)将含筛选培养基的固体平板直接暴露在空气中静置5-10天，待平板中出现产生蓝色圈菌苔。筛选培养基组成为：葡萄糖40-100g/L，碳酸钙3.5g/L、可溶性淀粉10g/L、碘化钾1.7g/L、琼脂15-20g/L，pH自然，溶剂为自来水，培养基无需灭菌，操作过程无需无菌操作。

2）在无菌条件下，挑取产生蓝色圈的菌苔，于含有划线分离培养基的固体平板中划线培养，待平板中出现产生蓝色圈的单菌落。划线分离筛选培养基组成为：葡萄糖80g/L、蛋白胨3g/L、硫酸铵0.4g/L、磷酸二氢钾0.19g/L、硫酸镁0.16g/L、碳酸钙3.5g/L、可溶性淀粉10g/L、碘化钾1.7g/L、琼脂粉15-20g/L，溶剂为去离子水，pH为5-6，121℃灭菌25min，培养温度为25-28℃，培养时间为48-72小时。

3）在无菌条件下，挑取产生蓝色圈的单菌落，接种于土豆琼脂培养基（PDA）固体斜面，25-28℃条件下活化2-3代，无菌条件下挑取活化后菌种，接种于土豆液体培养基（PDY），25-28℃，150-200rpm摇瓶培养24-48h，所获得种子液接种于液体发酵培养基，接种量5-10%，150-200rpm，培养温度为25-28℃，48-72h后收获发酵液待用。液体发酵培养基组成为：葡萄糖80g/L、蛋白胨3g/L、硫酸铵0.4g/L、磷酸二氢钾0.19g/L、硫酸镁0.16g/L、碳酸钙3.5g/L、溶剂为去离子水，pH为5-6，121℃灭菌25min。

4）用移液枪吸取2mL发酵液置于2ml eppendorf离心管中，5000-8000rpm离心5-10min，除去菌体后得上清液,然后采用滴定法测定上清液中葡萄糖氧化酶酶活。

具体实施方式：