[发明专利]一种凝胶培养基中β-内酰胺酶的酶活力定量检测方法

权利要求书

1.一种凝胶培养基中β-内酰胺酶的酶活力定量检测方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

1)采用明确效价单位数的青霉素G钠标准品用PH7.0的磷酸盐缓冲溶液精确配制不同浓度的青霉素G钠标准品溶液(mg/ml)，浓度范围从0～6mg/ml。

2)取各不同浓度的青霉素G钠标准品溶液1ml，加入中性羟胺(pH 6.75)1ml、95％乙醇1ml，反应3min，再加入硫酸铁胺溶液2ml，混匀&显色，待反应气泡消失后，测定OD₅₁₅值即A值。

3)以青霉素G钠浓度或单位数为横坐标，以OD₅₁₅值即A值为纵坐标，绘制标准曲线(图)，得到回归方程y＝ax+b，R²≥0.999。

4)精密称取含酶凝胶培养基(0.01g)，加入PH7.0的磷酸盐缓冲液浆化(酶解)制成澄明溶液，作为样品处理液。必要时于37±1℃保温1小时使样品溶液澄清。

5)将含酶平皿培养基的样品处理液用PH7.0的磷酸盐缓冲溶液按“1、2、3、4、5......倍数稀释”，即得样品稀释液。样品处理液若不稀释，稀释倍数＝1。

6)按样品处理液或样品稀释液的估计酶活力单位数，取适量体积(ml)的样品溶液于三角瓶中，按“1∶1.5～5.0”比例加入适量青霉素G钠标准品溶液，定容至20-30ml体积，得样品反应保温混合液，于37±1℃保温计时。

7)参照步骤2.方法操作，于保温“0”hr时取1ml样品保温反应混合液，加入各反应溶液，混匀&显色，待反应气泡消失后，测定OD₅₁₅值即A₀样。其余样品保温混合液于37±1℃保温计时1hr，于“1”hr时取1ml样品保温反应混合液，测定OD₅₁₅值即A₁样。

8)样品溶液检测时须做阴性对照测定，测定得到A₀阴和A₁阴。

9)依据测定结果，计算反应液的酶活，最终计算出每克培养基所含酶活力单位数。

2.根据权利要求1.所述“一种凝胶培养基中β-内酰胺酶的酶活力定量检测方法”，特征在于精密称取明确效价单位数的青霉素G钠标准品用PH7.0的磷酸缓冲液精确配制不同浓度的青霉素G钠标准品溶液(mg/ml)；依据技术方案方法，测定各不同浓度的青霉素G钠标准品溶液显色反应后的OD₅₁₅值，并以青霉素G钠浓度c％或单位数为横坐标，以OD₅₁₅值即A值为纵坐标，绘制标准曲线(图)，得到回归方程y＝ax+b，R²≥0.999。

3.根据权利要求1.所述“一种凝胶培养基中β-内酰胺酶的酶活力定量检测方法”，特征在于精密称取含酶凝胶培养基(0.01g)，加入PH7.0的磷酸盐缓冲液浆化(酶解)制成澄明溶液，作为样品处理液。将含酶平皿培养基的样品处理液用PH7.0的磷酸盐缓冲液按“1、2、3、4、5......倍数稀释”，即得样品稀释液。样品溶液若不稀释，稀释倍数＝1。

4.根据权利要求1.所述“一种凝胶培养基中β-内酰胺酶的酶活力定量检测方法”，特征在于样品保温反应混合液于保温“0”hr时和“1”hr时进行显色反应，测定OD₅₁₅值。

5.根据权利要求1.所述“一种凝胶培养基中β-内酰胺酶的酶活力定量检测方法”，特征在于依据测定结果，计算反应液的酶活，最终折算出每克培养基所含酶活力单位数。

6.根据权利要求1.所述“一种凝胶培养基中β-内酰胺酶的酶活力定量检测方法”，特征在于优选缓冲溶液为0.05M的磷酸盐缓冲液(PH7.0)，凝胶培养基浆化比(酶解)为1∶2～8；水解酶用量为20-60u/g；反应体系的体积为20～40ml，保温时间为1hr，保温温度37±1℃。β-内酰胺酶与底物反应比为“1∶1.5～5.0”。