[发明专利]一种凝胶培养基中β-内酰胺酶的酶活力定量检测方法

说明书

本发明公开了一种定量检测凝胶培养基中β‑内酰胺酶酶活力的测定方法，通过特别浆化处理方法将凝胶培养基制成澄明溶液，再利用羟胺与β‑内酰胺类抗生素生成青霉酰羟肟酸，羟肟酸与铁离子(Fe³⁺)生成棕红色化合物的显色原理，通过测定未被β‑内酰胺酶分解的青霉素含量来定量测定凝胶培养基中的β‑内酰胺酶活力。根据本发明的测定方法，凝胶培养基(处理液)中β‑内酰胺酶检出限为46u/g(ml)，样品溶液的定量线性范围为0U/ml～2000U/ml。

技术领域

本发明涉及药品领域，具体涉及一种凝胶培养基中β-内酰胺酶的酶活力定量检测方法。

背景技术

β-内酰胺酶检测从方法学上可以分为以下两种：1)通过测定未分解的酶促反应底物(青霉素)的含量来间接推算体系中β-内酰胺酶的浓度。该方法以生物测定法(杯碟法)及配体-受体检测法为代表，其特点是原理明确、特异性强。 2)通过测定底物青霉素分解产物的方法，青霉素经过β-内酰胺酶的分解之后生成稳定的中间产物-青霉噻唑酸，通过测定体系中青霉噻唑酸的含量将能够计算出β-内酰胺酶的含量。该方法以碘量法、产色头孢菌素法为代表。上述方法的不足在于或者耗时长或者偏差大或者属于半定量性质，无法满足“快速、准确”的检验要求。此外，沈祝飞等开发的“一种β-内酰胺酶培养基平板的活性检测方法”，也是一种半定量检测方法，而且该方法不能适用于表面凸起的接触皿。

因β-内酰胺类抗生素的大量及广泛使用，对各种β-内酰胺类抗生素的耐药菌不断增多，且耐药性不断增强，而产生β-内酰胺酶是出现耐药性的最主要原因，主要是由于它将β-内酰胺类抗生素分子中的β-内酰胺环水解，形成青霉噻唑酸，使β-内酰胺类抗生素失效。

目前中国药典中只有对液体β-内酰胺酶活性检测方法的规定(碘量法)，对凝胶培养基所含β-内酰胺酶的有效酶活力定量测定没有相应的方法和标准，国内外专利和文献尚无有关报道，现在市场上的加酶平皿均是以加酶量表示而无成品有效酶活标识，因此市场上的许多无菌β-内酰胺酶平皿的质量不合格(酶活力)，致使大量用户的环境监测结果不可信。

发明内容

本发明的目的是提供一种凝胶培养基中β-内酰胺酶的酶活力定量检测方法，该方法能快速、准确地定量检测出凝胶培养基所含的有效的β-内酰胺酶酶活力单位。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

1.采用明确效价单位数的青霉素G钠标准品，用PH7.0的磷酸盐缓冲溶液精确配制不同浓度的青霉素G钠标准品溶液(mg/ml)，浓度范围从0～6mg/ml。

2.取各不同浓度的青霉素G钠标准品溶液1ml，加入中性羟胺(pH 6.75)1ml、 95％乙醇1ml，反应3min，再加入硫酸铁胺溶液2ml，混匀&显色，待反应气泡消失后，测定OD₅₁₅值即A值。

3.以青霉素G钠浓度或单位数为横坐标，以OD₅₁₅值即A值为纵坐标，绘制标准曲线(图)，得到回归方程y＝ax+b，R²≥0.999。

4.精密称取含酶凝胶培养基(0.01g)，加入PH7.0的磷酸盐缓冲液浆化(酶解)制成澄明溶液，作为样品处理液。必要时于37±1℃保温1小时使样品溶液澄清。

5.将含酶平皿培养基的样品处理液用PH7.0的磷酸盐缓冲溶液按“1、2、3、 4、5......倍数稀释”，即得样品稀释液。样品处理液若不稀释，稀释倍数＝1。

6.按样品处理液或样品稀释液的估计酶活力单位数，取适量体积(ml)的样品(稀释)溶液于三角瓶中，按“1∶1.5～5.0”比例加入适量青霉素G钠标准品溶液，定容至20-40ml体积，得样品保温反应混合液，于37±1℃保温计时。