[发明专利]一种快速灵敏检测河豚毒素TTX的方法

说明书

本发明属于生物检测技术领域，为了解决现有测定方法存在的测定时间长、反应灵敏度低、选择性差、以及测定成本高昂等问题，提供了一种快速灵敏检测河豚毒素TTX的方法，将河豚毒素核酸适配体、小檗碱加入到磷酸缓冲溶液中，以小檗碱为荧光探针，河豚毒素核酸适配体为识别单元，加入待测物河豚毒素后诱导核酸适配体结构改变，核酸适配体与荧光探针小檗碱的结合受到影响，引起体系荧光信号改变，检测体系荧光强度值，计算获得待测物含量。简便、成本低、并且灵敏度高、选择性好，可用于实际生物样品的检测具有潜在的应用价值。

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种快速灵敏检测河豚毒素TTX的方法，利用小檗碱作为荧光探针检测TTX，在检测物TTX存在时诱导适配体结构的变化与荧光探针结合，实现荧光信号的变化。

背景技术

河豚毒素(tetrodotoxin，TTX)是一种毒性很强的小分子生物碱。其分子式为C₁₁H₁₇O₈N₃，分子量为319，该物质化学性质稳定，对热、日光、酶类、盐类及酸稳定，易溶于稀醋酸中。TTX的化学结构式如图1所示，为氨基全氢喹唑啉型化合物，最早是从河豚鱼中分离得到，近年来还发现河豚毒素不仅存在于河豚属的鱼类，还存在于虾虎鱼、章鱼、海星、蟹类以及腹足类，甚至还有鲎等众多的海洋生物中。河豚毒素毒性极强，食用0.5mg就可致人死亡，TTX通过与钠离子通道受体结合，阻断电压依赖性钠通道，从而阻滞动作电位导致与之相关的生理活动障碍，使人感觉神经麻痹，四肢瘫痪，呼吸困难，最后因呼吸抑制而死亡。目前还没有有效的解毒药。介于河豚毒素的严重危害，且化学性质稳定一般的烹饪手段并不能降解，有必要建立一种简便、 快速高效检测河豚毒素的方法。

核酸适配体是指能够通过空间构型互补与配体特异性紧密结合的一类单链寡核苷酸序列，英文名aptamer（源自于拉丁语 aptus，即适合配对之意）核酸适配体的出现源于1990年美国的Tuerk和Ellington提出的指数富集配体系统进化技术(systematicevolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)，这种通过独立地建立核酸文库，并从核酸文库里筛选出的能与多种靶分子高亲和性、高特异性结合的DNA或RNA寡核苷酸片段即核酸适配体。基于单链核酸适配体空间构象的多样性，当配体存在时，能够通过静电作用、氢键作用、范德华力、碱基配对或者形状匹配等作用形成稳定的三维空间结构，如假结(pseudoknot)、发卡(hairpin)、G-四链体(G- quadruplex)、凸环(bulge)等，进而特异性地结合各类靶分子，如金属离子、药物分子、氨基酸、核酸、多肽、蛋白质、病毒、细胞甚至整块组织等。由于其对应的靶分子范围甚广，大大拓宽了其应用领域，因此，核酸适配体被认为是构建传感器最理想的识别元件之一。

核酸适配体荧光传感器：荧光法是核酸适配体传感体系中应用最为普遍的光学检测方法，荧光法易操作、成本低、反应快且荧光检测技术中核酸适配体与荧光物质的作用方式灵活多样，荧光适配体传感平台是通过监测体系微环境变化所引起的荧光强度或荧光各向异性改变实现检测的，大多数荧光核酸适配体传感平台基于目标分子和核酸适配体亲和作用引起荧光强度的变化来检测目标分子；或者分别将荧光基团和猝灭基团标记于核酸适配体链端，通过将目标分子引入体系中引发荧光强度信号改变来定量分析待测物。

荧光探针小檗碱(Berberine)，亦称黄连素，是重要的异喹啉生物碱，小檗碱平面结构中含有可拓展的π-π体系，自身带部分正电荷，在水介质中几乎没有荧光，而保护性介质DNA加入后，由于DNA分子的碱基堆积作用以及互补碱基之间的氢键作用，为小檗碱分子提供了良好的疏水环境，另一方面，由于双螺旋DNA分子存在沟槽空间，加上小檗碱分子结构的空间效应，使得小檗碱更容易嵌入DNA中。同时，从静电作用看，小檗碱分子自身所带正电荷与DNA的磷酸骨架的负电荷也对二者的键合有贡献。因此，小檗碱分子嵌入易于嵌入DNA双螺旋结构中，从而使其荧光信号显著增强，基于它们较强的相互作用引起体系荧光强度的变化可进一步构建探针/核酸适配体荧光传感体系并用于靶分子检测。