[发明专利]一种鉴别美洲大蠊的DNA条形码标准检测片段16S rRNA、试剂盒及其使用方法

说明书

本发明涉及物种鉴定领域，提供一种用于鉴别美洲大蠊的试剂盒，该试剂盒包括阳性对照、正反向引物、PCR反应混合液以及蒸馏水，阳性对照采用如SEQ ID NO.1的DNA条形码标准检测片段16S rRNA，正反向引物的序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。本发明通过寻找到来源于美洲大蠊的16S rRNA基因片段(SEQ ID NO.1)，该片段在美洲大蠊物种的同源性在98～100％，而与非美洲大蠊的基因同源性显著降低，进而通过引物设计和PCR扩增可准确区分美洲大蠊与其他类似品种。本发明提供的试剂盒可用于鉴别粉末状或炮制品的美洲大蠊，检测范围更广，检测准确度更高，鉴别所需时间短。

技术领域

本发明涉及物种鉴定技术领域，具体涉及一种鉴别美洲大蠊的试剂盒及其使用方法。

背景技术

美洲大蠊(Periplaneta americana Linn.)是长期应用于民间的动物药药材，常以干燥或鲜成虫入药，主治儿童疳积、扁桃腺炎、身体包块、痈疮肿痛和蜈蚣叮咬等。近年来，研究表明美洲大蠊作为昆虫药物的临床应用记录显示，其具有抗肿瘤、治疗心血管疾病、促进组织修复、抗菌、抗病毒、抗氧化、增强免疫等药理作用，美洲大蠊药物制剂在临床上的应用也越来越广泛，而对美洲大蠊药材的真伪鉴定是入药及进行药理学研究的基础。

目前在国际范围内对昆虫的种类鉴定主要是依据成虫的形态学特征，而在中国的药材市场上，美洲大蠊药材通常以粉末或炮制品等形式入药。由于传统的性状鉴别缺乏准确的内部解剖特征或者是在贮藏、加工炮制过程中形态被严重破坏，因此基于形态结构细微差别的归类描述稳定性差、可信度低，导致药用美洲大蠊的鉴定存在很大困难。同时，由于传统的性状鉴别无法准确、快速的鉴定药材市场贩售的美洲大蠊药材，导致有部分伪品(例如药效不及美洲大蠊的澳洲大蠊、德国小蠊、甚或其它科属的昆虫)在市场内流通，市场较为混乱。

常规的分类学鉴别方法需要将美洲大蠊幼虫需要培养为成虫才能鉴定，耗时较长；对与残缺不全的昆虫药材炮制品、虫体粉末则基本上不能检测；以传统分类学方法鉴定美洲大蠊要求掌握昆虫，尤其是蜚蠊属昆虫形态分类学的专业技术人员才能对美洲大蠊成虫进行药材鉴定。因此，该昆虫药物的药材鉴定及原料药饮片的质量控制等均亟需寻求一种新的方法，以弥补传统分类学方法的缺陷及不足。

DNA条形码技术(DNA Barcoding)是对一个标准化、较短的基因片段的序列变异进行分析的一种分子技术，具有原理简单、操作便捷、可重复性强、准确率高、利于标准化等优点，是物种鉴定、发现隐存种和研究生物遗传多样性、生物系统进化、分类学和生物保护等的有力工具。随着分子生物技术和计算机技术的发展，DNA条形码这一新兴的技术己经得到了相关领域的越来越多科学家的广泛关注。近几年来，DNA条形码技术已被证明是一个行之有效的分子生物鉴定手段，可对传统形态鉴定方法作强有力的补充。但是，目前并没有一种准确性高的有效DNA条形码鉴别方法出现。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种用于鉴别美洲大蠊的DNA条形码标准检测片段16SrRNA，该片段来源于美洲大蠊16S rRNA基因，以该片段为目的基因可以有效区分美洲大蠊与其他类似品种。

本发明为此还提供了能够扩增上述DNA条形码标准检测片段16S rRNA的引物对，使DNA条形码标准检测片段16S rRNA能够被有效扩增。

本发明还提供了一种以所述DNA条形码标准检测片段16S rRNA为目的基因的鉴别试剂盒，采用该试剂盒对美洲大蠊鉴别的准确性高。

本发明还提供了一种上述试剂盒的使用方法，利用该试剂盒对美洲大蠊鉴别所需时间短，有利于对昆虫原料的快速鉴定。

为了解决上述问题，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种用于鉴别美洲大蠊的DNA条形码标准检测片段16S rRNA，所述标准检测片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。