[发明专利]脱氧胆酸钠沉淀法检测Hib结合疫苗中游离多糖的方法

权利要求书

1.一种脱氧胆酸钠沉淀法检测Hib结合疫苗中游离多糖的方法，其特征在于，包括以下操作步骤：

一、供试品预处理：

①结合原液预处理：取适量结合原液用灭菌注射用水按标示量稀释，即得结合原液的供试品溶液；

②成品预处理：取适量成品用灭菌注射用水按标示量溶解，取4.0ml于超滤离心管中，在温度为4℃、转速为7000-9000r/min的条件下超滤离心8-12min，收集浓缩液，补灭菌注射用水至总体积为4ml，重复8-10次上述在超滤离心后补灭菌注射用水的操作，吹打混匀后即得成品的供试品溶液；

二、游离多糖溶液的收集：量取步骤一中的结合原液或成品的供试品溶液，加入脱氧胆酸钠溶液，充分混匀后冰浴20-40min，再加入盐酸溶液，混匀后低温离心20-40min，收集上清液为游离多糖溶液；

三、核糖浓度的测定：使用化学法分别测定结合原液或成品的供试品溶液和游离多糖溶液中的核糖浓度，并将供试品溶液测得的核糖浓度记为C₁，将游离多糖溶液测得的核糖浓度记为C₂；

四、计算结合原液或成品中的多糖含量以及游离多糖的含量：

多糖含量(μg/ml)＝C₁*n₁/0.41

其中，n₁为供试品的稀释倍数；0.41为核糖含量和多糖含量的换算系数；

游离多糖含量(％)＝(C₂/C₁)×n₂×100％

其中，n₂为供试品溶液经脱氧胆酸钠处理过程中被稀释的倍数。

2.根据权利要求1所述的脱氧胆酸钠沉淀法检测Hib结合疫苗中游离多糖的方法，其特征在于，步骤二中精密量取步骤一中的供试品溶液1.00ml，加入1％脱氧胆酸钠500μl，充分混匀后冰浴30min，再加入0.1mol/L盐酸溶液300μl，混匀后在温度为4℃、转速为8000-12000r/min的条件下离心30min，收集上清液为游离多糖溶液。

3.根据权利要求1或2所述的脱氧胆酸钠沉淀法检测Hib结合疫苗中游离多糖的方法，其特征在于，所述结合原液的供试品中的多糖蛋白结合物含量为60-100μg/ml。

4.根据权利要求1或2所述的脱氧胆酸钠沉淀法检测Hib结合疫苗中游离多糖的方法，其特征在于，所述成品为Hib结合疫苗冻干剂，其规格为0.5ml/瓶，且每瓶中含纯化b型流感嗜血杆菌荚膜多糖不低于10μg。

5.根据权利要求1所述的脱氧胆酸钠沉淀法检测Hib结合疫苗中游离多糖的方法，其特征在于，步骤三中的化学法为地衣酚法，包括如下操作步骤：

a、量取1.0ml灭菌注射用水，依次加入三氯化铁盐酸溶液和地衣酚乙醇溶液，充分混匀后得到空白对照液；

b、量取若干份1.0ml不同浓度的核糖标准溶液，依次加入三氯化铁盐酸溶液和地衣酚乙醇溶液，充分混匀后得到标准对照液；

c、将供试品溶液或游离多糖溶液稀释至核糖浓度低于25μg/ml，作为样品溶液，随后量取1.0ml该样品溶液，依次加入三氯化铁盐酸溶液和地衣酚乙醇溶液，充分混匀后得到样品测定液；

d、将步骤a中的空白对照液、步骤b中的标准对照液和步骤c中的样品测定液均先置于沸水中水浴4-6min，再置于冰水中水浴25-35min，随后用冰水浴后的空白对照液作校准，测定各组标准对照液和样品测定液在波长670nm处的吸光度；

e、利用步骤d中各组标准对照液测得的吸光度制作以核糖标准溶液的浓度对核糖标准溶液相应的吸光度作回归直线方程；

f、将步骤d中样品测定液测得的吸光度代入回归直线方程中得到对应的C₁或C₂。

6.根据权利要求5所述的脱氧胆酸钠沉淀法检测Hib结合疫苗中游离多糖的方法，其特征在于，所述三氯化铁盐酸溶液的质量分数为0.1％，其添加量为5ml；所述地衣酚乙醇溶液的质量分数为0.1％，其添加量为0.4ml。