[发明专利]脱氧胆酸钠沉淀法检测Hib结合疫苗中游离多糖的方法

说明书

本发明公开了一种脱氧胆酸钠沉淀法检测Hib结合疫苗中游离多糖的方法，属于疫苗检测技术领域，其技术方案要点是，包括供试品预处理、游离多糖溶液的收集、核糖浓度的测定以及计算供试品中多糖含量以及游离多糖的含量的操作步骤，其先利用超滤法去除蔗糖，再利用脱氧胆酸钠沉淀多糖蛋白结物，从而准确的对Hib结合疫苗中的游离多糖含量加以测定，降低了Hib结合疫苗的生产成本。

技术领域

本发明属于疫苗检测技术领域，特别涉及一种脱氧胆酸钠沉淀法检测Hib结合疫苗中游离多糖的方法。

背景技术

流感嗜血杆菌是一类革兰氏阴性小杆菌，其可根据荚膜多糖组成和抗原性分为a、b、c、d、e、f型，b型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzzae Type b，Hib)致病力最强，与大多数严重局部感染和侵袭性感染有关。

Hib结合疫苗是利用纯化的Hib荚膜多糖与破伤风类毒素共价结合而成的多糖蛋白结合物，该多糖蛋白结合物能够引起机体胸腺依赖性免疫应答，其成功研制为预防如脑膜炎、肺炎等侵袭性Hib疾病提供了重要的工具。

在Hib结合疫苗生产过程中，以Hib荚膜多糖为主的游离多糖因其为T细胞非依赖性抗原，不但在再次免疫时不能使机体诱导免疫记忆应答，而且还会对Hib结合疫苗的稳定性和效力造成影响，因此该游离多糖通常作为杂质而被去除，并在Hib结合疫苗的原液和成品检测中将游离多糖含量的测定作为重要质量控制指标，以便于监控Hib结合疫苗在生产过程中游离多糖的去除效果。

目前，测定游离多糖含量的方法较多，其中脱氧胆酸钠(Sodium desoxycholate，DOC)沉淀法具有操作简单、重现性好、结果可靠等优点而被广泛应用。其工作原理为：脱氧胆酸钠在酸性条件下形成胶团，能够将蛋白物质加以沉淀，进而达到Hib结合疫苗中的多糖蛋白结合物与游离多糖分离的目的；最后再利用Hib结合疫苗中的游离多糖在酸性条件下易水解生成核糖的特点，该游离多糖的含量通过检测其水解所得的核糖含量来测定。

然而，Hib结合疫苗在结合原液制成成品的生产过程中还添加有蔗糖等赋形剂，以降低多糖蛋白结合物在冻干时被破坏的可能性，而蔗糖由一分子葡萄糖的半缩醛羟基与一分子果糖的半缩醛羟基彼此缩合脱水而成，其通过水解容易生成具有还原性的葡萄糖和果糖，进而对游离多糖的测定有较强的干扰，造成检测得到的游离多糖含量比实际高，从而导致Hib结合疫苗在制备过程中为达到检测标准而花费更多的人力物力，使得其生产成本较高。因此，目前急需一种检测精确度高的用于检测Hib结合疫苗中游离多糖的方法。

发明内容

针对以上现有技术的缺陷，本发明的目的是提供一种高精确度的检测Hib结合疫苗中游离多糖的方法，其中，本发明的发明人创造性的在进行脱氧胆酸钠处理前，先用超滤法去除蔗糖，以此减少Hib结合疫苗中蔗糖的含量，再利用脱氧胆酸钠沉淀多糖蛋白结物，从而准确的对Hib结合疫苗中的游离多糖含量加以测定，降低了Hib结合疫苗的生产成本。

本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：

一种脱氧胆酸钠沉淀法检测Hib结合疫苗中游离多糖的方法，其特征在于，包括以下操作步骤：

一、供试品预处理：

①结合原液预处理：取适量原液用灭菌注射用水按标示量稀释，即得结合原液的供试品溶液；②成品预处理：取适量成品用灭菌注射用水按标示量溶解，取4.0ml于超滤离心管中，在温度为4℃、转速为7000-9000r/min的条件下超滤离心8-12min，收集浓缩液，补灭菌注射用水至总体积为4ml，重复8-10次上述在超滤离心后补灭菌注射用水的操作，吹打混匀后即得成品的供试品溶液；

二、游离多糖溶液的收集：量取步骤一中的结合原液或成品的供试品溶液，加入脱氧胆酸钠溶液，充分混匀后冰浴20-40min，再加入盐酸溶液，混匀后低温离心20-40min，收集上清液为游离多糖溶液；