[发明专利]基于物种特异性PCR法快速检测常见家畜肉的试剂盒

说明书

本发明公开了一种基于物种特异性PCR法快速检测常见家畜肉的试剂盒，其包括DNA的提取部分和检测部分，反应体系中包含蛋白酶K等分子生物学试剂、十二烷基硫酸钠等普通化学试剂、2xTaq Plus Master Mix和各畜种所对应的特异性引物、ddH₂O等。该试剂盒对于牛肉、羊肉、猪肉、狗肉、马肉和驴肉的鉴别快速准确；除驴引物外，其他畜种引物的特异性均较强，不与其他物种发生交叉反应；灵敏性较高；在2.5h内就可以完成检测，快速省时且成本低，可同时对多个样品进行检测。本发明的试剂盒完全可用于熟肉制品的检测，为各食品检验机构提供了方法指导和技术支持，对于食品中畜源性成分的检测具有重要意义。

技术领域：

本发明涉及一种基因检测方法，特别涉及一种基于物种特异性PCR法快速检测常见家畜肉的试剂盒。

背景技术：

随着人们生活水平的提高和消费观念的转变，肉制品的需求量逐年攀升，在利益的驱使下，很多商贩为了提高商业利润，在高价肉及肉制品中掺入廉价肉，同时使用各种添加剂调整产品口味及色泽，以达到以假乱真的效果。尤其是牛、羊肉卷和羊肉串等加工制品，消费者难以从纹理和口感上对其进行甄别。这些掺假肉制品的出现不仅严重侵犯了消费者权益，更对消费者的身体健康造成了严重影响。因此，建立一种精准、快速、高通量的检测方法，为动物源性食品监管提供有力的技术支撑，是当前亟需解决的重要问题。

在日常生活中，肉类在经过切割、搅碎及斩拌，高压蒸煮及熏烤等深加工处理，且在烹调过程中加入大量的佐料和添加剂后，失去了其原有的形态特征，这增加了种源鉴定的难度，依靠感官和经验对肉类进行鉴别的传统方法已远不能满足需要。对食品中的肉类成分进行鉴别分析的技术总体可归为光谱检测、蛋白质检测和核酸检测三大类。其中，光谱检测法操作简单且对样品无损坏，但其定量不够准确；蛋白质分析法虽能进行定性、定量检测，但其不适用于蛋白质变性的产品；以核酸为基础的检测方法是以动物种属间遗传信息的差异作为检测靶点，其具有特异性强、不受组织类别限制等优势，已成为肉类成分鉴别的主流方法。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种基于物种特异性PCR法快速检测常见家畜肉的试剂盒，其能够解决现有技术中家畜肉掺假鉴别的成本高、检测时间长、误差大等问题。

本发明为了解决其技术问题所采用的技术方案是：

基于物种特异性PCR法快速检测常见家畜肉的试剂盒包括DNA的提取部分和检测部分，反应体系中包含蛋白酶K等分子生物学试剂、十二烷基硫酸钠等普通化学试剂、2xTaqPlus Master Mix(Dye Plus)和各畜种所对应的特异性引物、ddH₂O等。

上述试剂盒中所述DNA提取部分的反应包括以下步骤：

1)取100mg样品，放入2mL灭菌离心管中，加入500μLSDS裂解液和20μL蛋白酶K，混匀后在55℃条件下水浴至溶液透明(畜种不同，组织裂解时间也不同，且生、熟肉的组织裂解时间也不同，肉干等坚硬肉类组织可以先复水再水浴或适当延长水浴时间，需根据具体实验情况进行调整)，期间不时颠倒混匀离心管；

2)加入等体积Tris饱和酚，颠倒混匀后12000r/min离心10min，将上清液转移到另一离心管，重复此步操作一次；

3)随后在离心管中加入0.5倍体积的Tris饱和酚和0.5倍体积的氯仿/异戊醇(24:1)，混匀后12000r/min离心10min，吸取上清至另一新离心管；

4)加入0.1倍体积的乙酸钠溶液和2.5倍体积的4℃预冷的无水乙醇，颠倒混匀后有白色沉淀析出，在-20℃下沉淀2h；

5)将溶液和絮状沉淀均加入吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，12000r/min离心5min后，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中；