[发明专利]一种运载蛋白、重组表达载体、外泌体及制备方法与应用

权利要求书

1.一种运载蛋白，其特征在于：

其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的运载蛋白，其特征在于：

所述的运载蛋白包含与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少90％，优选至少95％，更优选地至少99％序列相同性的氨基酸序列，且可携带外源目标蛋白进入外泌体中。

3.一种编码权利要求1或2任一项所述的运载蛋白的基因，其特征在于：

其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.权利要求1或2任一项所述的运载蛋白在基因、蛋白或药物递送系统的应用，所述的运载蛋白与待表达的外源目的蛋白进行融合表达后，所述的运载蛋白携带所述的外源目的蛋白进入外泌体中。

5.一种分泌表达外源蛋白的重组表达载体，其特征在于：

所述的重组表达载体含有权利要求1或2任一项所述的运载蛋白，并在所述的运载蛋白的基因序列后面添加多克隆位点序列，使其他所携带的目的蛋白在多克隆位点插入，在动物细胞中融合表达，并被带入外泌体。

6.一种携带外源蛋白的外泌体的制备方法，其特征在于，包括如下制备步骤：

(1)构建含有权利要求1或2任一项所述的运载蛋白的基因片段和外源目的蛋白肽段基因片段的重组表达载体，得到含有融合蛋白的重组表达载体；

(2)将所述的重组表达载体转染细胞；

(3)培养阳性细胞，使阳性细胞分泌表达载有所述外源蛋白的外泌体；

(4)从细胞培养上清分离得到所述的外泌体。

7.根据权利要求6所述的携带外源蛋白的外泌体的制备方法，其特征在于：

步骤(1)的步骤为：将所述的运载蛋白的基因片段和外源目的蛋白肽段基因片段通过接头连接后，利用限制性内切酶切割，用T4DNA连接酶与表达载体进行连接，构建得到重组表达载体，连接的顺序为运载蛋白的基因片段-接头-目的蛋白肽段基因片段；

所述的外源目的蛋白为EGFP蛋白、bFGF蛋白；

所述的接头的氨基酸序列为DSAGSAGSAG；

所述的分离为通过超速离心方法或外泌体提取试剂盒从所述的细胞培养上清中分离得到所述的外泌体。

8.根据权利要求7所述的携带外源蛋白的外泌体的制备方法，其特征在于：

步骤(3)中所述的表达为稳定表达或瞬时表达；

所述的表达载体为pcDNA3.4；

所述的超速离心方法的具体步骤为：

(1)300g离心细胞培养上清10min，2000g离心细胞培养上清10～20min，弃沉淀留取第一上清液，以去除细胞；

(2)第一上清液10000g离心30min，弃沉淀留取第二上清液，以去除亚细胞成分；

(3)第二上清液100000g离心70～90min，弃掉上清液，留取第一沉淀物，所述的沉淀为外泌体和一些可溶性蛋白；

(4)用PBS溶液重新悬浮步骤(3)得到的第一沉淀物，混匀后再以100000g离心70～90min，以洗去可溶性蛋白，洗涤沉淀后得到所述的外泌体；

步骤(1)～(4)均在4℃下进行。

9.一种外泌体，其特征在于：

通过权利要求6～8任一项所述的制备方法制备得到。

10.权利要求9所述的外泌体在基因、蛋白或药物的递送系统的应用。