[发明专利]一种运载蛋白、重组表达载体、外泌体及制备方法与应用

说明书

本发明提供了一种运载蛋白、重组表达载体、外泌体及制备方法与应用。所述的运载蛋白可以通过与外源目的蛋白融合，高效地携带外源目的蛋白进入外泌体中。本发明还提供了一种重组表达载体，可将待表达的外源蛋白肽段基因序列插入至所述的重组表达载体的多克隆位点上，实现高效、定向地使外源蛋白在细胞的外泌体中表达。同时，本发明还提供了一种携带外源蛋白的外泌体的制备方法，可有效地将外源目的基因带入外泌体中，操作简单易行，工艺稳定，适用性好。通过所述的制备方法制得的外泌体含有外源目的蛋白，并具有很好的细胞通透性，转染细胞的效率高，同时可发挥外源目的蛋白的活性与功效，具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种运载蛋白、重组表达载体、外泌体及制备方法与应用。

背景技术

1981年，Trams等在透射电镜下发现了一组比多泡体还要小的、直径在40～1000nm的囊泡样物质。1987年，Johnstone等命名这种膜泡为外泌体(exosomes)，这种囊泡是由细胞质膜凹陷形成的，因而其外膜与细胞膜为同样的物质，配体-受体相互作用、胞饮/吞噬或膜融合来进入受体细胞。天然形成的外泌体本身可以携带诸如RNA，蛋白质等大量成分。这些特点使得人们产生了将这种细胞天然产生的外泌体作为药物包载系统的想法。

外泌体作为药物载体进行药物运输有独特的优势，主要体现在：(1)当使用自源外泌体时，外泌体引起的有害免疫反应极低；(2)外泌体在人血液中的稳定性好；(3)向细胞转运“货物”的效率高；(4)外泌体运载药物时具有一定的靶向性；(5)外泌体直径在40～100nm之间，因此可以很好地利用增强渗透滞留(EPR)效应，有选择性地渗入到肿瘤或者炎症组织部位。

目前已经尝试用外泌体携带siRNA，化学小分子药物等进行基因治疗和肿瘤治疗等研究。然而对于大分子蛋白质药物，用现在常用的电穿孔，转染，孵育等包载药物的手段则非常困难。同时，目前对于外泌体携带细胞内蛋白的机制仍不清楚，外泌体携带胞内物质都是随机的，如何让目的蛋白进入外泌体成为亟待解决的技术难题。

发明内容

本发明的第一目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种运载蛋白，该运载蛋白可以高效地携带外源目的蛋白进入外泌体。

本发明的第二目的在于提供编码所述的运载蛋白的基因。

本发明的第三目的在于提供一种分泌表达外源蛋白的重组表达载体，该重组表达载体可以使外源蛋白在细胞中表达并将其携带进入外泌体。

本发明的第四目的在于提供一种携带外源蛋白的外泌体的制备方法。

本发明的第五目的在于提供所述的外泌体及其应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种运载蛋白，所述的运载蛋白可以高效地携带外源目的蛋白进入外泌体，其氨基酸序列如下所示(SEQ ID NO.1)：

MPRPRLLAALCGALLCAPSLLVALDICSKNPCHNGGLCEEISQEVRGDVFPSYTCTCLKGYAGNHCETKCVEPLGLENGNIANSQIAASSVRVTFLGLQHWVPELARLNRAGMVNAWTPSSNDDNPWIQVNLLRRMWVTGVVTQGASRLASHEYLKAFKVAYSLNGHEFDFIHDVNKKHKEFVGNWNKNAVHVNLFETPVEAQYVRLYPTSCHTACTLRFELLGCELNARKADLRRGADDREQ

所述的运载蛋白包含与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少90％，优选至少95％，更优选地至少99％序列相同性的氨基酸序列，且可携带外源目标蛋白进入外泌体中。

如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或者几个氨基酸的氨基酸序列。