[发明专利]一种无菌微拟球藻的制备方法

权利要求书

1.抗生素在制备无菌微拟球藻（Nannochloropsis gaditana）中的应用，其特征在于，向活化好的微拟球藻（Nannochloropsis gaditana）藻液中分批依次加入以下抗生素处理：

首先，加入25~100 μg/mL氯霉素处理1~7 d，离心，收集藻体，洗涤后培养1d；其次，加入25~150 μg/mL四环素处理3~7 d，离心，收集藻体，洗涤后培养1d；然后，加入25~400 μg/mL头孢曲松钠处理3~7 d，离心，收集藻体，洗涤后培养；

所述微拟球藻（Nannochloropsis gaditana），已于2018年8月1日保藏于中国普通微生物保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.16188。

2.一种无菌微拟球藻（Nannochloropsis gaditana）的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）微拟球藻（Nannochloropsis gaditana）的培养：将微拟球藻（Nannochloropsis gaditana）重新转接至新鲜f/2培养基中培养，藻液与培养液以1:10比例进行转种活化；

（2）向步骤（1）活化好的微拟球藻（Nannochloropsis gaditana）藻液中分批依次加入以下抗生素处理：

首先，加入25~100 μg/mL氯霉素处理1~7 d，离心，收集藻体，洗涤后培养1d；其次，加入25~150 μg/mL四环素处理3~7 d，离心，收集藻体，洗涤后培养1d；然后，加入25~400 μg/mL头孢曲松钠处理3~7 d，离心，收集藻体，洗涤后培养；

所述微拟球藻（Nannochloropsis gaditana），已于2018年8月1日保藏于中国普通微生物保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.16188。

3.根据权利要求2所述的一种无菌微拟球藻（Nannochloropsis gaditana）的制备方法，其特征在于，还包括步骤（3）除菌效果检验：

取步骤（2）抗生素处理后，在无抗生素培养基中生长一周的藻液涂布于2216E固体培养基，28~30℃生化培养箱中培养3~4d，检测藻液中是否有菌；

取步骤（2）抗生素处理后，在无抗生素培养基中生长一周的藻液，加入SYBR荧光染料避光染色15~20 min，制片后荧光显微镜观察除菌效果；

取步骤（2）抗生素处理后，在无抗生素培养基中生长一周的藻液进行PCR，用琼脂糖凝胶电泳验证PCR产物，检测藻液中是否有菌。

4.根据权利要求2所述的一种无菌微拟球藻（Nannochloropsis gaditana）的制备方法，其特征在于，还包括步骤（4）抗生素处理后微拟球藻（Nannochloropsis gaditana）生长活性检测：抗生素处理完成后，定期取样，用酶标仪测定藻液的荧光强度，以检测藻类是否能正常生长。

5.根据权利要求2所述的一种无菌微拟球藻（Nannochloropsis gaditana）的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述的抗生素及其浓度分别为：100 μg/mL的氯霉素、150 μg/mL的四环素和400μg/mL的头孢曲松钠。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述培养条件为温度为24±1（℃），光照强度为3000 lux，光暗比为12 L：12 D，pH为6.5~7.0。

7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，洗涤和培养所用的溶液为新鲜f/2培养基。

8.权利要求2~7任一所述的制备方法得到的无菌微拟球藻。