[发明专利]一种无菌微拟球藻的制备方法

说明书

本发明公开一种无菌微拟球藻(Nannochloropsis gaditana)的制备方法，以抗生素的抑菌/杀菌作用为基础，通过筛选具有高效抑菌/杀菌活性，且对藻类毒性小，同时具备不同抑菌/杀菌机制的抗生素，以不同种类抗生素协同作用的方式，达到去除微拟球藻(Nannochloropsis gaditana)中细菌的目的；所述抗生素及其浓度分别为25～100μg/mL的氯霉素、25～150μg/mL的四环素和25～400μg/mL的头孢曲松钠。本方法工艺简单，便于操作，可推广性强，采用本发明制备的无菌藻株仍保持良好的活性，可正常生长。

技术领域

本发明属于微藻的无菌化制备技术领域，具体涉及采用抗生素处理的方法去除微拟球藻藻液中细菌制备无菌微拟球藻的方法。

背景技术

微藻是一种重要的生物资源，具有分布广、营养丰富、种类繁多、适应能力强、可定向培养等特点，在饲料、医药研发、污水处理及化工等领域有广泛应用。微拟球藻是海洋微藻大眼藻纲中的主要种群，能高产不饱和脂肪酸，且生长迅速，是水产养殖中常见的饵料微藻。

在微拟球藻的常规培养中，藻液中存在大量不同种类的杂菌，这些菌与藻之间存在很多未知且复杂的关系，而这显然无法满足对藻类生理生化、分子遗传及藻菌关系等方面的研究，因此获得无菌纯藻具有极为重要的意义。目前，无菌藻的制备仍是藻类学研究中的一个难点。常见的制备无菌藻的技术有涂布划线法、离心洗涤技术、辐照技术、毛细吸管技术及抗生素法等，其中涂布划线法是获得纯培养物的经典方法，但该方法不普遍适用，有研究人员采用稀释结合涂布划线纯化螺旋藻但未获成功，因为该藻具有胶质鞘,且运动能力强；离心洗涤技术就是反复离心，其能在一定程度上消除细菌，但对于大多数藻类并不能实现无菌化，只能增加纯分离的可能性，因此，在无菌化研究中,离心洗涤可作为其他无菌化研究方法的辅助措施；辐照法存在繁琐、工作量大、成功率低、适用范围窄等缺点，且辐照的藻体生理特性易受影响，易突变，易出现致死效应，不能保证筛选到自然状态的藻株，难以获得理想的结果；毛细吸管技术对可能附着在藻细胞上的杂菌，毛细吸管法通常无法去除，若与显微技术结合，则对设备要求较高，操作熟练程度要求较高。相较而言，抗生素法是一种可操作性强，适用范围广的无菌藻制备技术。抗生素具有抑(杀)菌作用，采用抗生素纯化微藻，通常除了考虑对细菌的毒性，还须考虑抗生素对微藻形态或(和)生理、生化特性的可能影响，因此选用合适的抗生素是关键，理想的抗生素应具备两个特点，即抑(杀)菌活性强和对藻毒性小或促进藻生长的特点。林伟在几种海洋微藻的无菌化培养中筛选出4种抗生素，即氯霉素、青霉素、庆大霉素和卡那霉素，通过试验表明，6种微藻中褐胞藻只需要2种抗生素青霉素和庆大霉素即可实现无菌化，但培养3代培养液中又出现了细菌，但通过添加卡那霉素，且添加顺序为青霉素、庆大霉素和卡那霉素(3种抗生素)后，微小原甲藻、前沟藻及褐胞藻3种微藻培养液即可实现完全无菌化；通过抗生素混合培养试验发现，通过连续处理2次，4种微藻实现无菌化，剩余2种微藻中，微小原甲藻微藻生长受到严重抑制，培养40天死亡，褐胞藻培养液内细菌仍未有效排除，通过调整抗生素浓度，将三种抗生素合用，仍未排除了褐胞藻培养液内细菌，所以，藻类无菌化过程中抗生素种类、数量及其浓度和作用时间及添加抗生素的方法起着至关重要的作用。因此，由于微藻种类或生活环境不同，其杂菌群落亦不同，抗生素种类、数量及其浓度和作用时间及添加抗生素的方法，对获得健康的无菌藻株成为难点，对藻类实现无菌化具有不可预期性。目前还没有采用抗生素法制备无菌微拟球藻的专利报道。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的是提供一种微拟球藻的无菌化培养方法，本发明选用的微拟球藻(Nannochloropsis gaditana)是从青岛卓越海洋集团养殖废水中分离得到的，已于2018年8月1日保藏于中国普通微生物保藏管理中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC No.16188。本发明针对微拟球藻的生长特点，提供合适的抗生素种类及其浓度，以及抗生物的添加方式和作用时间，为获得健康的无菌微拟球藻提供方法，为后期准确研究微拟球藻奠定基础。

本发明的目的通过以下技术方案来实现：