[发明专利]一种脐带间充质干细胞重层化培养的方法及其产物应用

权利要求书

1.一种脐带间充质干细胞重层化培养的方法，其特征在于，包括以下步骤：

a）分离、提取和培养健康人脐带间充质干细胞；

b）通过无血清重层化培养基对脐带间充质干细胞进行重层化培养；

所述的步骤b）中，无血清重层化培养基由以下成分组成：DMEM/F12、PDGF-BB、 bFGF、TGF-β1、EGF、转铁蛋白Transferrin和抗坏血酸；其中，PDGF-BB含量为50～100 ng/mL；bFGF含量为0～50 ng/mL；TGF-β1含量为0～20ng/mL；EGF含量为0～30 ng/mL；转铁蛋白Transferrin含量为2.0～4.5 mg/mL、抗坏血酸含量为10~100 ng/mL；

所述的步骤b）中，重层化培养方法如下：将步骤a）中培养的融合度达到P2代脐带间充质干细胞更换成无血清重层化培养基进行培养，每隔2天换液，并收集上清，培养至第14~15天获取重层化培养细胞层。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤b）中，无血清重层化培养基由以下成分组成：DMEM/F12、80ng/mL PDGF-BB、20ng/mL bFGF、10ng/mL TGF-β1、10ng/mLEGF、3.0mg/mL转铁蛋白和100 ng/mL抗坏血酸。

3.利用权利要求1或2所述方法制得的产物制备活性因子和/或生物活性膜的方法，所述的产物包括培养上清及重层化细胞层，

所述的活性因子的制备方法如下：将获取的重层化培养细胞层的培养上清通过45μm的滤网过滤后，通过3kD的滤膜进行超浓缩至原上清体积的1/20，得到浓缩液，然后通过0.22μm滤网过滤后加入冻干赋型剂，通过1℃/min程序降温至-80℃凝固备用；将凝固样本进行抽真空，升华干燥，除去冰晶，最后制得冻干活性因子，-20℃保存；

所述的生物活性膜的制备方法如下：将获取的重层化培养细胞层用镊子掀起，防止蜷曲，平铺至洁净膜上，加入PBS，4℃保存，即得生物活性膜。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤b）中，冻干赋型剂为甘露醇、葡萄糖、海藻糖、蔗糖或乳糖中的至少一种，加入量为浓缩液的15~20% w/w。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的洁净膜是无纺布、蚕丝膜、天丝膜、生物纤维膜和超导膜中的一种。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的生产过程中不添加任何的血清和抗生素。

7.根据权利要求3-6任意一种方法制备的活性因子在制备生物学活性功能的产品的应用。

8.根据权利要求3-6任意一种方法制备的生物活性膜在制备生物学活性功能的产品的应用。