[发明专利]一种脐带间充质干细胞重层化培养的方法及其产物应用

说明书

本发明公开了一种脐带间充质干细胞重层化培养的方法，包括以下步骤：a）分离、提取和培养健康人脐带间充质干细胞；b）通过无血清重层化培养基对脐带间充质干细胞进行重层化培养。利用脐带间充质干细胞重层化培养的方法产物制备生物活性膜的方法，所述的产物包括培养上清及重层化细胞层，培养上清通过特殊的低温真空冻干技术制成活性因子；重层化细胞层与洁净膜组合制成生物活性膜。还公开了生物活性膜在制备生物学活性功能的产品的应用。本发明的有益效果是：可以获得高水平的活性因子和重层化细胞层。并且此方法通过特殊的低温真空冻干技术，获得活性因子纯度、稳定性更高，通过重层化细胞层与洁净膜结合可以制成生物活性膜。

技术领域

本发明涉及一种细胞培养技术领域，特别涉及一种脐带间充质干细胞重层化培养的方法及其产物应用。

背景技术

脐带间充质干细胞是一种分离自健康婴儿胎盘的成体干细胞。脐带间充质干细胞能够分泌许多细胞因子如EGF、bFGF、TGF-β、TGF-α、HGF、IGF、VEGF、KGF等及许多干细胞外泌体，还能分泌collagenⅠ和collagenⅢ。脐带间充质干细胞及其分泌活性因子在再生医学领域已经得到广泛的研究和应用。

脐带间充质干细胞是一种贴壁依赖性细胞，而且由于接触抑制，只能单层培养，传统的贴壁培养的制备工艺复杂，需要不断地进行传代，分泌的活性因子水平也较低。大大影响了脐带间充质干细胞及其活性因子的产品开发，而且传统的制备工艺均是在含血清、含抗生素的条件下进行，会引入许多风险因素，影响活性因子的纯度，给产品开发带来一系列的困难。

综上，现有技术存在如下技术问题：

一是细胞培养中获取的活性因子水平较低；

二是细胞培养过程中存在许多风险因素。

发明内容

本发明的目的在于提供一种脐带间充质干细胞重层化培养的方法，此方法在于通过特殊的无血清重层化培养基来培养脐带间充质干细胞，此方法培养的细胞能够分泌更高水平的活性因子，并且能够获得重层化的细胞层，大大提高使用率。

本发明的另一个目的在于提供一种脐带间充质干细胞重层化培养的方法，此方法为无血清和无抗生素培养，风险因素大大减小。

本发明的另一个目的在于一种脐带间充质干细胞重层化培养的方法，此方法通过特殊的低温真空冻干技术，获得活性因子纯度、稳定性更高，且重层化细胞层与洁净膜组合可以制成生物活性膜。

本发明的另一个目的在于一种脐带间充质干细胞重层化培养的产物在具有生物学活性功能的产品，如化妆品或保健品中应用，具有极高的社会及经济效益。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种脐带间充质干细胞重层化培养的方法，包括以下步骤：

a)分离、提取和培养健康人脐带间充质干细胞；

b)通过无血清重层化培养基对脐带间充质干细胞进行重层化培养；

所述的步骤b)中，无血清重层化培养基由以下成分组成：DMEM/F12、PDGF-BB、bFGF、TGF-β1、EGF、转铁蛋白Transferrin和抗坏血酸；其中，PDGF-BB含量为50～100ng/mL；bFGF含量为0～50ng/mL；TGF-β1含量为0～20ng/mL；EGF含量为0～30ng/mL；转铁蛋白Transferrin含量为2.0～4.5mg/mL、抗坏血酸含量为10～100ng/mL；

所述的步骤b)中，重层化培养方法如下：将步骤a)中培养的融合度达到P2代脐带间充质干细胞更换成无血清重层化培养基进行培养，每隔2天换液，并收集上清，培养至第14～15天获取重层化培养细胞层。

优选地，