[发明专利]一种从A.terreus次级代谢产物中分离提取新化合物的制备方法

说明书

本发明公开了一种从A.terreus次级代谢产物中分离提取新化合物的制备方法，包括孢子制备、菌株发酵、次级代谢产物萃取和分离纯化，具体步骤为：向真菌培养基中添加表观遗传修饰调控剂TSA、烟酰胺、二胜肽，发酵培养，分别萃取发酵液、菌丝体，发酵浓缩物经柱色谱、高效液相色谱分离纯化，得到分离提取的新化合物。有益效果为：本发明在培养基中添加烟酰胺、二胜肽，与表观遗传修饰调控剂TSA产生协同增益作用，对A.terreus OUCMDZ‑2739进行表观修饰，有效激活该菌株沉默基因的表达，并分离得到新次级代谢产物；本发明制得的新化和物，具有较好的抗肿瘤效果。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种从A.terreus次级代谢产物中分离提取新化合物的制备方法。

背景技术

众所周知，微生物早已成为抗生素、酶抑制剂等活性物质的重要来源。微生物由于可以大规模发酵培养，无原料限制，不会破坏环境等优点已成为天然产物研究领域的热点。近年来从陆地微生物中获得新化合物的概率大幅降低，而海洋来源微生物由于高压、高盐、低温、寡营养的独特生存环境，导致其具有与陆生微生物截然不同的代谢途径，除可产生与陆地相似的代谢产物之外，更易产生一些结构特异的新次级代谢产物，进而表现出良好的生物活性如：抑制群体感应活性、抑菌活性、抗病毒活性、蛋白激酶抑制活性、细胞毒活性、肿瘤细胞周期抑制活性等。海洋来源微生物具有巨大的开发利用前景。

曲霉属真菌一直以来都是天然产物界研究的重要菌种其次级代谢产物结构新颖骨架多变，除了常规的甾体，倍半萜，蒽醌等常见结构类型以外，往往还含有：生物碱类，肽类、聚酮类、二倍半萜等多种的骨架。这些结构新颖的化合物往往还含有细胞毒，抗菌，抗病毒等多种活性，成为海洋药物先导化合物的重要来源之一，引起了业内学者的广泛关注。

现有技术如授权公告号为CN 104031845 B的中国发明专利，公开了一种制备速度快，产物纯度高的海洋青霉菌及其次级代谢产物Flufuran的发酵工艺，其发酵过程为1)将海洋青霉菌接种在PDA上在25℃培养箱中培养2d后，挑取单菌落再接种到PDA培养基上于25℃培养2d后备用；2)将活化菌种接种于PDB中，在25℃、150rpm的条件下培养1d得到种子液；3)取种子液按体积分数5％的接种量接种于发酵培养基中，于25℃，150rpm的条件下培养12d；4)将发酵液过滤取上清液乙酸乙酯萃取3次，去除有机相后用甲醇复溶得到进样液；5)采用高速逆流色谱法对进样液进行分离纯化得到产品。但该海洋青霉菌及其次级代谢产物Flufuran的发酵工艺没有经过表观遗传修饰，所得次级代谢产物不是新次级代谢产物。

发明内容

本发明的目的在于提供一种由表观遗传修饰调控剂TSA修饰的，次级代谢产物多，发酵物萃取率高的从A.terreus次级代谢产物中分离提取新化合物的制备方法。

本发明针对上述技术中提到的问题，采取的技术方案为：

本发明用菌种由青岛石老人海水浴场的浒苔样品的共附生真菌，通过化学和生物学方法共同筛选所得。

一种从A.terreus次级代谢产物中分离提取新化合物的制备方法，包括孢子制备、菌株发酵、次级代谢产物萃取和分离纯化，具体步骤为：

孢子制备：将置于-80℃超低温冰箱保藏的菌株A.terreus OUCMDZ-2739的甘油冻存管置于洁净操作台中，复苏10min，用灼烧灭菌后的接种环蘸取已复苏的冻存液，在新鲜配置的PDA斜面固体培养基中均匀划线，然后，斜面培养基置于28℃恒温培养箱中培养3-5天，培养菌株斜面至成熟，得丰满孢子，备用；