[发明专利]一种猪圆环病毒3型毒株及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种猪圆环病毒3型毒株PCV3‑LY及其应用。该病毒是国内外首次通过感染性克隆技术拯救出的猪圆环病毒3型,接种贴壁生长的单层猪肾细胞PK15细胞培养后，进行D‑氨基葡萄糖处理而后继续培养，收获细胞培养物作为下一轮传代的接种物，依次连续传代获得一株细胞培养适应毒株。在适应过程中，传至15代后可以观察到明显的细胞病变。经过间接免疫荧光证实该细胞能够支持猪圆环病毒3型的有效复制。病毒的滴度lgTCID₅₀＝10^6.53/mL。动物回归试验发现5头28日龄猪攻毒后可以致死两头，该病毒对仔猪致病力较强。这是国内外首次通过感染性克隆技术拯救出的猪圆环病毒3型，为进一步研究PCV3的致病机制以及开展有效防控该病的疫苗研究提供直接支持。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种猪圆环病毒3型毒株、其制备方法及应用。

背景技术

猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)属于圆环病毒科(Circoviridae)圆环病毒属(Circovirus)成员。猪圆环病毒颗粒为二十面体对称、无囊膜包裹的、单股环状DNA病毒。在电镜下，猪圆环病毒是一种无囊膜的呈二十面体对称的圆形小颗粒病毒，直径17nm，具有单股环状的DNA基因组。猪圆环病毒对氯仿、碘酒、酒精等有机溶剂不敏感，可在70℃稳定存活15分钟，但对苯酚、季胺类化合物、氢氧化钠和氧化剂等试剂较敏感。2016年前根据致病性、抗原性和核酸序列的差异，将PCV分为PCV1和PCV2。PCV1于1974年由德国学者Tischer等首次从污染的猪肾传代细胞系PK15分离获得，通过人工感染猪试验证实，该病毒没有引起显著临床症状和病理变。

PCV2于1998年首次报道，发现其是断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的主要病原。PMWS在临床上以断奶仔猪呼吸急促、腹泻、贫血、间质性肺炎和进行性消瘦以及明显的淋巴结病变为主要特征。1997年在加拿大西部发现PMWS以后，在世界上许多国家和地区都有该病的报道。该病主要发生在5～12周龄仔猪。除此之外，PCV2也能够引起猪皮炎肾病综合征(PNDS)、母猪繁殖障碍、新生仔猪腹泻病、增生性坏死性肺炎(PNP)、猪呼吸道综合征及仔猪先天性震颤等多种猪圆环相关疾病(PCVAD)。在中国，该病是由郎洪武等首次发现的。目前，我国PCV2感染的形势亦相当严峻。近年来，以PCV2为主要病原引起的猪圆环病毒病在世界范围内广泛流行，该病毒主要侵害猪的免疫系统，并能够造成机体的免疫抑制，对全世界的生猪养殖造成了重大的经济损失。

2016年，在美国北卡罗莱纳州的一个商品化猪场，猪场工作人员发现母猪死亡率增加了10.2％，受孕率降低了0.6％。猪场中一部分母猪表现厌食，皮肤呈现多灶性丘疹，斑点和表面皮炎，这些临床症状与传统的猪圆环病毒病引起的临床症状相似，但对所有母猪和胎儿组织进行免疫组化和荧光定量PCR检测都未检测到对PCV2、猪流行性腹泻病毒、高致病性蓝耳病病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒等。随后研究人员进行病毒分离，检测到一种新型的圆环病毒3型(PCV3)。该病毒基因组长为2,000bp，其能引起猪的皮炎肾病终合症、繁殖障碍及心脏和多系统的炎症反应，但是如何能够获得活的圆环病毒3型(PCV3)，目前的分离方法还无法获得。

目前，猪圆环病毒3型(PCV3)为一种新发的猪传染病的病原菌，其能引起猪的皮炎肾病综合症、繁殖障碍及心脏和多系统的炎症反应，该病原菌对猪场疾病控制十分重要，这需要对我国PCV3感染情况进行全面的调查。由于我国新发现的猪圆环病毒3型与美国的猪圆环病毒3型有差异，所以目前尚无针对该病原的有效措施。因此，研制PCV3的诊断试剂和疫苗已成当务之急。而采用常规方法来分离PCV3病毒极易污染外源病毒。因而开展PCV3感染性分子克隆的研究对该病毒致病机理以及增殖特性相关方面的研究具有重要的意义，以期为进一步深入研究猪圆环病毒病疫苗，为深入研究PCV3与宿主相互作用的分子机制以及病毒的分子流行病学研究奠定了基础，这对该病毒的监控以及之后的控制和预防尤为重要。

发明内容