[发明专利]一种快速检测恩诺沙星残留的方法

权利要求书

1.一种快速检测恩诺沙星残留的方法，其特征在于：包括下列步骤：

第一步：包被原制备

将恩诺沙星加入二甲基甲酰胺，超声溶解后用冷乙醇冷却得到恩诺沙星的二甲基甲酰胺溶液，再将三乙胺和氯甲酸异丁醋加入到所述恩诺沙星的二甲基甲酰胺溶液中，室温搅拌反应；再将牛血清白蛋白的碳酸缓冲液溶液逐滴加入，继续搅拌反应5～7h；然后将反应液装入透析袋，在4℃条件下，用生理盐水溶液透析45～50h，换生理盐水溶液6次，透析结束后将透析液过0.2μm的滤膜，得到的滤液即为包被原；

第二步：免疫原制备

将恩诺沙星加入二甲基甲酰胺，超声溶解后将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺加入其中，室温反应过夜得到第一溶液；卵清蛋白溶解于碳酸溶液，然后逐滴加入到所述第一溶液中，继续搅拌3～5h；然后将反应产物用生理盐水透析45～50h，将透析液过0.2μm的滤膜，得到的滤液即为免疫原；

第三步：光纤传感器抗包被原修饰

将APS光纤传感器末端没入不同浓度的包被原溶液中，室温静置4～6min，然后将光纤生物传感器末端没入15％蔗糖中，室温静置0.5～1.5min，然后室温晾干，置于2～8℃干燥保存备用；

第四步：光纤传感器抗原包被修饰

将APS光纤传感器末端没入包被原溶液中，室温静置5min；再将APS光纤生物传感器末端没入质量分数为15％的蔗糖水溶液中，室温静置1min，然后室温晾干后置于2～8℃干燥条件下保存，备用；

第五步：抗体用量确定

将恩诺沙星-BSA偶联物用磷酸盐缓冲液稀释20倍，取200μL于微孔板的第2列；将喹诺酮抗体用磷酸缓冲盐溶液稀释至30、10和3.3μg/mL，分别取200μL于微孔板的第4列；往微孔板第1列中加入200μL水，往第3列加入200μL PBS-BSA；用APS探头进行检测：第一列60s，第2列60s；第3列60s；第4列300s；

第五步：体系的建立

采用10μg/mL的喹诺酮抗体作为检测抗体浓度，用磷酸缓冲盐溶液将恩诺沙星标准品至稀释100、50、25、12.5、6.25、3.12、1.56和0ng/ml，取200μL梯度稀释的标准品加入微孔板的第4列中，往微孔板的第1、2、3列中依次加入200μL水、200μL 20倍稀释的恩诺沙星-BSA偶联物、200μL PBS-BSA进行检测；检测流程如下：第一列30s，第2列60s；第3列60s；第4列300s；

第六步：非标记检测

平衡：将光纤传感器末端没入阴性待检液体中120s；检测：将光纤传感器末端没入待测液体中300s；阴性待检液体包含：200μL的待检液体和50μl磷酸盐缓冲液；待测液体包含200μL待测样品、50μL磷酸盐缓冲液和2μg喹诺酮抗体；

第七步：金标记检测

平衡：将光纤传感器末端没入待检液体中120s；检测：将光纤传感器末端没入待测奶液中600s；所述待检液体包含200μl待检液体、50μL缓冲液和5μL金标BSA；所述待测奶液包含200μL待测牛奶、50μL缓冲液和5μL金标喹诺酮抗体。

2.根据权利要求1所述的快速检测恩诺沙星残留的方法，其特征在于：非标记方法检测的灵敏性在12～13ng/ml，金标记检测方法的灵敏性可达到2～3ng/ml。

3.根据权利要求1所述的快速检测恩诺沙星残留的方法，其特征在于：第六步中的待检液体为不含恩诺沙星的与待测样品相同种类的材料。

4.根据权利要求1所述的快速检测恩诺沙星残留的方法，其特征在于：第七步中的待检液体为不含恩诺沙星的牛奶。