[发明专利]使用短短芽孢杆菌分泌表达超敏蛋白的方法

说明书

本发明涉及一种使用短短芽孢杆菌分泌表达超敏蛋白的方法，所述的方法包括如下步骤，(1)将超敏蛋白的编码基因插入到以短短芽孢杆菌为宿主的质粒中，(2)将插入了所述超敏蛋白的质粒转入短短芽孢杆菌宿主中，(3)发酵培养所述短短芽孢杆菌，(4)分离提取所述超敏蛋白。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体而言，涉及一种使用短短芽孢杆菌分泌表达超敏蛋白的方法。

背景技术

化肥和农药是提高作物产量和防治病虫害的主选产品，但同时产生了环境、能源以及成本等方面的问题，成为现在困扰世界各国的经济与社会发展的重大，严重制约着农业的可持续性发展。而利用来自微生物或真菌的蛋白质制备的生物制品(包括生物肥料和生物农药)是当代作物优质、高效和无公害生产的主要措施。近年来，国内外在此方面已开展了大量的科学研究。早期的微生物蛋白主要是来自苏云金芽孢杆菌的杀虫晶体蛋白(ICP),新型微生物蛋白主要是蛋白激发子类物质，目前研究报道的具有代表性的新型微生物蛋白主要有过敏蛋白(Harpin)、隐地蛋白(Cryptogein)和激活蛋白(Activator)，这些蛋白质不直接杀灭害虫和病原物，也不直接提供营养物质，而是在促进植物生长发育和对营养物质的吸收、增强植物的广谱抗病性(包括对多种细菌、真菌和病毒的抗性)、增强植物的驱虫性、增强植物的抗逆性(植物对干旱、严寒、盐碱等不良环境的耐受性)、延长作物产品的储存时间、对盆花和苗木的塑形作用方面有广泛应用前景。因此，它们可以配制成生物制品，应用到以上方面。

这些新型微生物蛋白或多肽大都通过发酵重组大肠杆菌等生物工程菌来实现大批量生产，在发酵后的下一步工艺为溶解细菌悬浮液中的细菌细胞以释放微生物蛋白或多肽。细胞溶解的方法有非化学的方法，如高压或超声波处理，使用该方法对设备要求较高，能耗高且难以大规模应用。作为另外的选择，大部分厂商采用将细胞悬浮液与溶菌酶接触来进行，之后还需要进行40-42℃消化，离心去细胞碎片和变性蛋白，以及蛋白纯化工艺以达到需要的纯度。这些工艺操作复杂，成本昂贵，且由于步骤多，过程冗长，会降低微生物蛋白和多肽的收率，并降低它们的生物活性和稳定性。

因此，需要有步骤简便、成本低廉的方法用于这类新型微生物蛋白或多肽的生产。

发明内容

为了解决上述问题，提供一种简便、快速的超敏蛋白的制备方法，本发明提供如下技术方案。

本发明首先涉及一种使用短短芽孢杆菌(Brevibacillus choshinensis)作为宿主菌，发酵培养生产目的蛋白的方法，所述的方法包括如下步骤，

(1)将所述目的蛋白的编码基因插入到以短短芽孢杆菌为宿主的质粒中，

(2)将插入了所述目的蛋白的质粒转入短短芽孢杆菌宿主中，

(3)发酵培养所述短短芽孢杆菌，

(4)分离提取所述目的蛋白。

步骤(1)所述的目的蛋白为超敏蛋白、优选为来源于菌株Erwinia amylovora的GeneBank编号为M92994.3的harpinEa蛋白；

步骤(1)所述的质粒为pNC-hisT质粒；

步骤(2)所述的将质粒转入短短芽孢杆菌宿主中的方法为电击转化方法；

步骤(3)所述的发酵培养的培养条件为：T2培养基、温度30～33℃、转速120～200rpm、发酵培养时间24～60h，优选的，发酵培养条件是：T2培养基、温度33℃、转速120rpm、发酵培养时间48h；

步骤(4)所述的分离提取所述目的蛋白的步骤是：收集发酵后的菌液，离心收集上清，对上清液进行切向流超滤及浓缩，获得目的蛋白超滤浓缩液。

所述的切向流超滤的步骤是：