[发明专利]一种适用于单细胞真核藻类基因组大小的测定方法

权利要求书

1.一种适用于单细胞真核藻类基因组大小的测定方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）待测藻类的材料准备：待测藻类无菌培养物，离心去上清，再用无菌水漂洗2～3次，去除培养基成分，获得藻细胞；所述的待测藻类无菌培养物中藻细胞密度为1×10³～1×10⁵个/mL；所述的离心的速度为3000～5000 rpm；

（2）内参选择：仪器调试后进行样品荧光强度及基因组大小的预测，根据预测基因组大小选择莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）为主要内参，眼点拟纳绿球藻（Nannochlropsis oculata）和/或盐生拟微绿球藻（Microchloropsis salina）为第二内参，并依据内参基因组大小进行相互校正；

（3）细胞壁破坏及色素的去除：待测藻类和内参藻类，按照每10⁵个藻细胞加入1～2 mL甲醇的量；将甲醇分别加入到待测藻类和内参藻类的藻细胞中，常温下磁力搅拌破坏细胞壁及叶绿体结构去除叶绿素的干扰，每次1～2h，离心去上清，重复提取3～5次，直到细胞变为白色；然后按照每10⁵个藻细胞加入0.1～0.2 mL Lysis buffer LB01重悬细胞，于冰上裂解处理，获得细胞核悬浮液；

所述的待测藻类为类波氏真眼点藻（Eustigmatoscf. polyphem）或星形魏氏藻（Vischeria stellata）；

所述的离心的速度为3000～5000 rpm；

所述的Lysis buffer LB01的配方为：以200 mL计，363.4 mg Tris 、148.9 mgNa₂EDTA、34.8 mg四盐酸精胺、1.193 g KCl、233.8 mg NaCl和 200 µL 0.1%v/v TritonX-100；

（4）藻细胞核染色：按照1 mL细胞核悬浮液加入50 µg PI、50 µg RNase和5µL β-巯基乙醇的量，混匀后避光染色，之后取细胞核悬浮液进行流式细胞仪分析测定待测藻类和内参藻类的荧光值，计算待测藻类基因组大小。

2.根据权利要求1所述的一种适用于单细胞真核藻类基因组大小的测定方法，其特征在于：还包括：

（5）高通量测序验证待测藻类的基因组，综合评估待测藻类的基因组大小与复杂性。

3.根据权利要求1或2所述的一种适用于单细胞真核藻类基因组大小的测定方法，其特征在于：

步骤（3）中所述的裂解处理的时间为0.5～1 h；

步骤（4）中所述的避光染色的条件为于4℃，避光染色30～60min。

4.根据权利要求1或2所述的一种适用于单细胞真核藻类基因组大小的测定方法，其特征在于：

步骤（4）中所述的流式细胞仪分析的条件如下：激发波长488 nm，流速20 µL/min，每次至少收集10⁴个细胞，重复3次以上，变异系数＜5%，利用Flowjo X V10软件进行图像和数据的处理分析，获得待测藻类和内参藻类的PI荧光强度；待测藻类基因组大小由下列计算公式给出：待测藻类基因组大小=待测藻类荧光强度/(内参藻类荧光强度×内参藻类基因组大小)。