[发明专利]一种适用于单细胞真核藻类基因组大小的测定方法

说明书

本发明公开一种适用于单细胞真核藻类基因组大小的测定方法。本发明基于单细胞真核藻类的特性，优化了细胞核的提取与染色方法，获得了较为准确的流式细胞分析结果，并与高通量二代illumina测序技术相结合，综合评估藻细胞的基因组大小，明确基因组的特征。该技术方法优化了传统植物流式细胞分析，利用甲醇去除了藻细胞色素和细胞壁的干扰，大大的提高了PI的染色效果，提高了流式细胞分析的准确性，同时结合目前较为前沿的高通量测序技术，综合分析了待测物种基因组结构特征，可为后续物种的遗传结构研究和全基因组测序的组装策略的制定提供理论依据。

技术领域

本发明涉及一种适用于单细胞真核藻类基因组大小的测定方法，通过流式细胞分析和二代测序技术联合分析藻类基因组大小，特别涉及微藻物种。

背景技术

为了确定一个未知物种复杂性，首先需要从基因组水平了解基因组的特征，快速获得未知的物种基因组大小。通常使用流式细胞术(flow cytometry，FCM)，利用外标法或内标法，利用碘化丙啶(PI)对细胞核进行荧光染色后，利用流式细胞仪进行测定。FCM是目前最普遍使用的估测物种基因组大小的方法之一，相比较早的脉冲场凝胶电泳等手段，具有操作简单，样品制备流程短等显著优点，在动物、植物以及部分真菌中有较好应用。但对于不同物种，特别是不同类型的物种需要优化FCM的测定方法，如细胞壁破碎、细胞核提取和染色条件优化，提高FCM技术的准确性。

微藻(单细胞真核藻类)是一类系统发生各异、个体较小、通常为单细胞或群体的、能进行光合作用的水生低等生物。目前，对于单细胞真核微藻物种的基因组评估的研究较少，由于其细胞较小，且通常含有较厚的细胞壁，加之细胞内存在大量的色素和次生代谢产物，会降低PI的荧光强度。此外，由于不同藻类物种之间的进化尺度较大，同一科的物种基因组大小差异可能会很大，因此，对于内参物种的选择严重地影响了流式细胞法测定基因组大小的准确性，需要我们进一步明确适合于单细胞真核藻类基因组测定方法。

发明内容

为了解决目前单细胞真核微藻基因组大小准确测定的技术困难，本发明的目的在于提供一种适用于单细胞真核藻类基因组大小的测定方法。

目前基于二代测序技术的基因组小片段文库的低深度测序数据，通过K-mer分析，能够有效地评估基因组大小、GC含量、杂合度以及重复序列的含量等相关信息，也是全面了解某一物种基因组特征的有效方法。因此，我们优化流式细胞分析方法，并与高通量测序数据相结合，将准确全面地评估待测藻类物种基因组的大小，对后续藻类资源的系统学和基因组学研究具有重要理论意义。准确的获得基因组大小估测后，可为后续的遗传与进化分析及全基因组测序的组装策略的制定提供帮助。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种适用于单细胞真核藻类基因组大小的测定方法，包括如下步骤：

(1)材料准备：单细胞真核藻类无菌培养物，离心去上清，再用无菌水漂洗2～3次，去除培养基成分，获得藻细胞；

(2)内参选择：仪器调试后进行样品荧光强度及基因组大小的预测，根据预测基因组大小选择莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)为主要内参，眼点拟纳绿球藻(Nannochlropsis oculata)和/或盐生拟微绿球藻(Microchloropsis salina)为第二内参，并依据内参基因组大小进行相互校正；

(3)细胞壁破坏及色素的去除：待测藻类和内参藻类，按照每10⁵个藻细胞加入1～2mL甲醇的量；将甲醇分别加入到待测藻类和内参藻类的藻细胞中，常温下磁力搅拌破坏细胞壁及叶绿体结构去除叶绿素的干扰，每次1～2h，离心去上清，重复提取3～5次，直到细胞变为白色；然后按照每10⁵个藻细胞加入0.1～0.2mL Lysis buffer LB01重悬细胞，于冰上裂解处理，获得细胞核悬浮液；