[发明专利]一种人类哮喘风险基因多态性检测试剂盒及其制备方法和应用

权利要求书

1.引物组，其特征在于，所述引物组由普通的外引物和带荧光标签的特异性的ARMs引物组成，具体序列如下：用于扩增CYSLTR1基因rs7216389位点的特异性引物序列如SEQ IDNO.1~ SEQ ID NO.4所示，其中SEQ ID NO.2所示引物的5’端携带FAM荧光基团，SEQ IDNO.4所示引物的5’端携带VIC荧光基团；用于扩增GSDML基因rs7216389位点的特异性引物序列如SEQ ID NO.5~ SEQ ID NO.8所示，其中SEQ ID NO.6所示引物的5’端携带FAM荧光基团，SEQ ID NO.8所示引物的5’端携带VIC荧光基团；用于内控的引物序列如SEQ ID NO.9~SEQ ID NO.10所示。

2.探针组，其特征在于，所述探针组由特异性taqman-MGB探针和携带淬灭基团的锁核酸探针组成，核苷酸序列如SEQ ID NO.11~ SEQ ID NO.13所示，具体形式如下：

内控-P：5’-ROX-ACCACCACGGCCGAGC-MGB-BHQ-3’

野生型淬灭基团锁核酸：5’-BHQ-ACGATGACAAGGGAT-3’

突变型淬灭基团锁核酸：5’-BHQ-TCATCAATGTATCTT-3’ 。

3.一种检测试剂盒，包含权利要求1所述引物组和权利要求2所述探针组，其特征在于，所述试剂盒由分别用于扩增CYSLTR1、GSDML位点的PCR预混反应液、阳性对照品及阴性对照品组成；

所述PCR预混反应液的具体组分如下：

（1）用于扩增CYSLTR1位点的PCR预混反应液包括：所述用于扩增CYSLTR1基因rs320995位点的引物、引物序列如SEQ ID NO.1~ SEQ ID NO.4所示，用于内控的引物序列、序列如SEQ ID NO.9~ SEQ ID NO.10所示，所述探针组、序列如SEQ ID NO.11~ SEQ ID NO.13所示，以及PCR反应液组成；

（2）用于扩增GSDML位点的PCR预混反应液包括：所述用于扩增GSDML基因rs7216389位点的引物、引物序列如SEQ ID NO.5~ SEQ ID NO.8所示，用于内控的引物序列、序列如SEQID NO.9~ SEQ ID NO.10所示，所述探针组、序列如SEQ ID NO.11~ SEQ ID NO.13所示，以及PCR反应液组成；

所述阳性对照品包括：CYSLTR1基因rs320995位点野生型质粒、CYSLTR1基因rs320995位点突变型质粒、GSDML基因rs7216389位点野生型质粒、GSDML基因rs72163809位点突变型质粒及内参基因质粒DNA；

所述阴性对照品包含不包含内标基因和目的基因位点的重组质粒。

4.根据权利要求3所述检测试剂盒，其特征在于，所述PCR预混反应液中，探针组内taqman-MGB探针的浓度为50~100nM，携带淬灭基团的锁核酸探针的浓度均为100~400nM；用于扩增各位点的不带荧光基团的各引物浓度均为100~400nM，带荧光基团的各引物浓度均为50~100nM；用于内控的引物的浓度均为100~400nM。

5.根据权利要求3所述检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液包括Premix qPCRmix和TE缓冲液。

6.权利要求3~5任一项所述检测试剂盒在制备用于检测人类哮喘风险基因多态性产品中的应用。

7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，具体检测方法包括如下步骤：

（1）采用基因组DNA提取试剂盒提取待测人外周血的基因组DNA作为待检测样本；

（2）荧光定量检测：向反应管中加入PCR预混反应液和待测样本DNA；同时设置阳性对照组和阴性对照组，然后将反应管置于荧光PCR仪进行PCR扩增反应，并采集FAM、VIC和ROX荧光信号；

（3）PCR扩增反应结束后，根据所采集的荧光信号起线情况进行结果判定。