[发明专利]一种滨麦基因组特异分子标记的应用

权利要求书

1.一种滨麦基因组特异分子标记引物在滨麦品种鉴定过程中的应用。

2.根据权利要求2所述的应用，所述滨麦基因组特异分子标记引物的序列如SEQ:ID:NO:1-SEQ:ID:NO:34所示。

3.根据权利要求1所述的滨麦基因组特异分子标记引物在滨麦品种鉴定过程中的应用，其特征在于，将扩增得到的滨麦序列与参考基因组和华山新麦草的序列进行比对，从而得到滨麦特异的序列，具体应用方法如下：

步骤1.将普通小麦7182、滨麦、华山新麦草用以上EST-STS特异性引物标记进行PCR扩增，具体方法如下：

(1)扩增反应体系，总体性10μL，包含以下成分：

(2)扩增程序：

94℃预变性4min；

94℃变性45sec，

60℃退火45sec，

72℃延伸1min30sec，

循环35次；

72℃延伸10min；

12℃保存；

(3)整个过程在S1000型热循环仪(Bio-Rad,California,USA)上进行；

步骤2.琼脂糖凝胶电泳

取10μL PCR扩增产物加入2μL 6×Loading dye，混匀，用1.5％琼脂糖凝胶检测,通过紫外凝胶成像仪Champ Gel 5000扫描照相，统计条带，分析多态性，并选取普通小麦7182、滨麦及华山新麦草间存在明显差异且较明亮的条带进行切胶，将胶块切下后放到对应的编好号码的1.5ml离心管，存放于4℃备用；

步骤3.PCR产物切胶回收

PCR产物的切胶回收使用天根公司的Universal DNA Purification Kit，具体操作按试剂盒说明书进行：

(1)吸附柱CB2中加入500ulBL，4℃，12000rpm，离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管；

(2)将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下放入干净的离心管中，称取重量；

(3)向胶块中加入等体积PC(如果胶块重为0.1g，体积视为100ul，则加入100ulPC)，50℃水浴放置10min，期间不断温和的上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解；

(4)将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB2中，4℃，12000rpm，离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管；

(5)向CB2中加入600ul漂洗液PW，使用前先加乙醇，4℃，12000rpm，离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管；

(6)重复(5)；

(7)将CB2放入收集管中，4℃，12000rpm，离心2min，尽量除去漂洗液，将吸附柱置于温室放置数分钟，彻底晾干；

(8)将CB2放入一个干净离心管中，向吸附柱中间位置悬空滴加适量的68℃预热的洗脱缓冲液，EB:ddH₂O＝2:1，室温放置5min，4℃，12000rpm，离心2min，收集DNA溶液；

步骤4.PCR产物与载体的连接

使用TaKaRa公司的pMD19-T Vector进行连接：

(1)连接体系：

回收的PCR产物 4.5ul

SolutionI 5.0ul

pMD19-T Vector 0.5ul

(2)16℃连接过夜，8～10h；

步骤5.配置固体LB培养基1L

调PH7.0，加10M NaOH，不含Amp，定容至1000ml；再在121℃灭菌30min；超净台上倒板；

步骤6.转化

(1)将-80℃保存的DH5a感受态细胞置于冰上溶解；待溶解后，吸取5ul的连接产物于20ul感受态细胞中，轻轻吹打均匀，冰浴30min；

(2)42℃热激75s，迅速在冰中冷却3min：

(3)加入880ulLB培养基，不加抗生素，37℃，200rpm振荡培养1h；

(4)3500～4000rpm室温离心2min，吸出600ul上清，吸打剩余菌液，混匀；

(5)吸出100ul，涂于Amp+/LB平板上，氨苄终浓度为100ug/ml；

(6)37℃倒置培养10h；

步骤7.挑菌

(1)准备8连管表示后放入无菌操作台，开紫外灭菌15-20min；

(2)每个PCR管加入30ul灭菌ddH₂O；

(3)用10ul的移液枪挑菌，每一个单一菌落对应一个PCR管，轻轻吸打数次；

步骤8.菌落PCR检测

为了验证阳性克隆，进行菌落PCR检测，故将菌液进行PCR扩增；

(1)扩增体系10μL，如下：

(2)扩增程序：

94℃预变性4min；

94℃变性45sec，

60℃退火45sec，

72℃延伸1min30sec，

循环35次；

72℃延伸10min；

12℃保存；

(3)整个过程在S1000型热循环仪上进行；

(4)琼脂糖检测

取10μL PCR扩增产物加入2μL 6×Loading dye，混匀，用1.5％琼脂糖凝胶检测,通过紫外凝胶成像仪扫描照相，分析条带；

步骤9.测序

将单一条带对应的菌液加到含Amp+的液体LB培养基中37℃，200rpm振荡培养3-4h，再将筛选到的阳性菌落送到北京奥科鼎盛生物科技有限公司测序部进行测序；本文所有测序工作都由北京奥科鼎盛生物科技有限公司测序完成；

步骤10.序列分析

由北京奥科鼎盛生物科技有限公司测序出来的结果用BioEdit软件以及NCBIhttps://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi在线分析。