[发明专利]一种TNF相关激活诱导细胞因子的制备方法

说明书

本发明提供了一种TNF相关激活诱导细胞因子的制备方法，该方法中所述的TNF相关激活诱导细胞因子（核因子κB受体活化因子配基receptor activator of NF‑κB Ligand，RANKL）是增加了GST标签的融合蛋白，经过原核表达系统表达，在原核表达中RANKL所带标签，该方法中的GST融合蛋白的标签无需另外添加特异性蛋白酶酶切，而是经过GST融合蛋白自切去除。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地本发明涉及一种TNF相关激活诱导细胞因子的制备方法。

背景技术

TNF相关激活诱导细胞因子，TNF-related activation-induced cytokine（TRANCE），又名为细胞核因子κ B受体活化因子配体（Receptor Activator for NuclearFactor-κ B Ligand），osteoprotegerin ligand （OPGL），骨保护素配体 osteoclastdifferentiation factor（ODF ），破骨细胞分化因子。

TNF相关激活诱导细胞因子（核因子κB受体活化因子配基receptor activator ofNF-κB Ligand，RANKL）是一种Ⅱ型跨膜蛋白，是具有诱导破骨细胞分化、发育、发挥功能的因子。NF-κB受体激活体（receptor activator of NF-κB，RANK）是一种Ⅰ型跨膜蛋白，是RANKL的唯一受体，是RANKL发挥功能的关键。骨保护素是一种分泌型糖蛋白，与RANKL竞争性与RANK结合抑制骨吸收。许多激素、细胞因子、生长因子通过作用于核因子κB受体活化因子配体，骨保护素影响骨代谢，而导致骨代谢疾病如骨质疏松，溶骨性骨肿瘤及恶性肿瘤骨转移等，RANKL过表达，可导致一系列骨疾病，如风湿性关节炎，银屑病性关节炎。

现有技术中RANKL生产的方式，原核表达系统表达，生产周期短，生产成本低，但是采用原核表达系统表达RANKL会使用His标签或GST标签等。标签的使用，一是能构成表位利于纯化和检测；二是构成独特的结构特征（结合配体）利于纯化。His是组氨酸残基组成的融合标签，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力，可用于固定化金属螯合层析(IMAC)，对重组蛋白进行分离纯化。

GST（谷胱甘肽巯基转移酶）标签蛋白本身是一个在解毒过程中起到重要作用的转移酶，它的天然大小为26KD。将它应用在原核表达的原因大致有两个，一个是因为它是一个高度可溶的蛋白，希望可以利用它增加外源蛋白的可溶性；另一个是它可以在大肠杆菌中大量表达，起到提高表达量的作用。GST融合表达系统广泛应用于各种融合蛋白的表达，可以在大肠杆菌和酵母菌等宿主细胞中表达。结合的融合蛋白在非变性条件下用10mM 还原型谷胱甘肽洗脱。在大多数情况下，融合蛋白在水溶液中是可溶的，并形成二体。GST标签可用酶学分析或免疫分析很方便的检测。标签有助于保护重组蛋白免受胞外蛋白酶的降解并提高其稳定性。在大多数情况下GST融合蛋白是完全或部分可溶的。

GST融合蛋白纯化：该表达系统表达的GST标签蛋白可直接从细菌裂解液中利用含有还原型谷胱甘肽琼脂糖凝胶(Glutathionesepharose)亲和树脂进行纯化。GST标签蛋白可在温和、非变性条件下洗脱，因此保留了蛋白的抗原性和生物活性。GST在变性条件下会失去对谷胱甘肽树脂的结合能力，因此不能在纯化缓冲液中加入强变性剂如：盐酸胍或尿素等。

针对GST融合蛋白中的GST标签的去除，采用位点特异性蛋白酶进行切除，如凝血酶、Xa因子、PreScission蛋白酶等。为了去除GST标签而加入的特异性蛋白酶，为后续的纯化有增加了负担，同时也增加了生产成本。

发明内容

本发明提供了一种TNF相关激活诱导细胞因子的制备方法，该方法中的GST融合蛋白的GST标签是经过GST融合蛋白自切而去除，不需要另外添加特异性蛋白酶酶切。