[发明专利]一种LDH纳米颗粒与核酸分子偶联物的制备方法

说明书

本发明属于纳米材料和生物技术领域，具体为一种LDH纳米颗粒与核酸分子偶联物的制备方法及其在植物遗传转化中的应用。通过混合配制的镁铝溶液和氢氧化钠溶液，以及水浴8h和超声波组合处理，制得的LDH纳米颗粒具有分散性好，稳定性强的特点，吐温‑20在LDH纳米颗粒与核酸分子偶联过程中可有效防止纳米颗粒发生聚集而形成沉淀，提高LDH纳米颗粒与核酸分子偶联物导入植物细胞能力；利用LDH纳米颗粒与核酸分子偶联物进行植物遗传转化，操作简单、成本低、不需要特殊的仪器；不受外源核酸分子种类、大小和受体材料基因型的限制；在种子萌发过程中即可实现外源基因的导入，从而避免了农杆菌侵染和组织培养等复杂的实验操作过程，缩短了获得遗传转化材料的时间。

技术领域

本发明属于纳米材料和生物技术领域，具体为一种LDH纳米颗粒与核酸分子偶联物的制备方法及其在植物遗传转化中的应用。

背景技术

植物细胞的特征在于细胞壁主要由纤维素和果胶多糖组成，有效保护植物细胞不受外来无机颗粒或附著在细胞表面的洗涤剂等物质的渗透。因此，植物中的基因转化在很大程度上依赖于基于农杆菌介导的遗传转化方法，这种方法严重受到基因型的限制，且目前只适用于大多数的双子叶植物和极少部分单子叶植物。近年来，无机纳米颗粒作为纳米级的输送器引起了人们的广泛关注。然而，细胞壁在许多情况下阻碍了纳米颗粒在植物细胞中的应用。例如，多壁碳纳米管(MWCNTs)、介孔二氧化硅纳米颗粒(MSN)、二氧化钛和氧化铈纳米颗粒都未能穿透植物细胞。有的纳米颗粒可以进入植物细胞，但却表现出较高的细胞毒性，对质膜和细胞骨架造成损害。

层状双金属氢氧化物，简称LDH(Layered double hydroxide)，一般包含两种及两种以上的金属离子，是一种具有层状结构和特殊性能的新型功能材料。LDH不仅具有高阴离子交换能力和高氧化还原活性等特点，而且制作成本低、污染少，因此有着广泛的用途。由于独特的结构和性质，基于LDH的核壳结构纳米复合材料具有很多优秀的物理化学性能，如高表面积、磁性和多孔结构等。这些性能使得它们在催化、药物输送、废水净化、能量转换和存储以及超级电容器等方面都有着潜在的应用价值。

因此在遗传转化领域，将LDH纳米颗粒作为输送器，发挥其输送活性，将核酸分子直接导入到植物细胞体内，减少对植物细胞本身的伤害，且不受细胞壁以及基因型的限制，将具有广阔的应用前景。然而，现有的LDH纳米颗粒普遍存在生物兼容性不好、载体容量低、性能不稳定等问题，因而导致转化效率低。因此如何制备高性能的LDH纳米颗粒以及装载成有效的LDH纳米颗粒与核酸分子偶联物成为实现其应用的核心问题。

另外，目前对于小片段的核酸分子，例如dsRNA，已经可以利用LDH纳米颗粒实现植物细胞的导入，并在同源的植物病毒RNA干扰应用上产生了一定效果(Mitter N,Worrall EA,Robinson K E,et al.,Clay nanosheets for topical delivery of RNAi forsustained protection against plant viruses[J].Nat Plants,2017.3:16207.；WO2015/089543 A1)。但在质粒载体等大片段的成功导入上，还没有研究报道。因此，要想替代或弥补传统的农杆菌介导的遗传转化方式的不足，大片段导入的成败与否也同样重要。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种LDH纳米颗粒与核酸分子偶联物的制备方法，包括以下步骤：

1)配制镁铝溶液；

2)配制氢氧化钠溶液；

3)按照1：4的体积比混合上述步骤1)和步骤2)中获得的镁铝溶液和氢氧化钠溶液，收集、洗涤和重悬沉淀，得到纳米颗粒乳浊液；

4)将所述步骤3)中得到的纳米颗粒乳浊液进行水浴处理；

5)将上述步骤4)中水浴处理后的纳米颗粒乳浊液进行超声波处理，制得LDH纳米颗粒；