[发明专利]一种抑制牦牛RXFP2基因表达的shRNA、慢病毒及其构建方法和用途

说明书

本发明针对牦牛RXFP2基因，设计合成干扰shRNA，连接到慢病毒载体中，制备出重组慢病毒质粒载体，然后将重组慢病毒质粒载体与病毒包装成所需的辅助载体共转染到293T细胞中，获得靶向RXFP2基因RNA干扰的重组慢病毒载体，为进一步研究牦牛RXFP2的功能奠定基础。本发明设计的shRNA能够有效降低RXFP2基因的表达量，细胞实验证明，利用上述shRNA构建的慢病毒介导的牦牛RXFP2基因RNA干扰载体，能够显著降低RXFP2基因在细胞内的表达，并能够改变牦牛Bmu‑S1细胞的细胞周期、抑制其增殖并促进其凋亡。

技术领域

本发明涉及一种抑制牦牛RXFP2基因表达的shRNA，以及利用该shRNA构建的慢病毒介导的牦牛RXFP2基因干扰载体及应用。

背景技术

松驰素家族受体2(RXFP2)又称富含亮氨酸的G蛋白偶联受体8（LGR8），属于G蛋白偶联受体(GPCR)家族，是胰岛素样因子3(INSL-3)在体内的特异性受体。RXFP2在2005年被鉴定到，并命名为GREAT基因，哺乳动物的RXFP2基因主要在睾丸、子宫、肾、脑、肺等组织表达。研究表明，RXFP2和INSL-3基因突变和缺失与隐睾发生的密切相关，INSL-3由睾丸间质细胞产生，通过旁分泌作用到达睾丸引带与RXFP2结合，促进cAMP的产生和睾丸引带的发育。

许多研究表明RXFP2对羊角性状有显著的影响，其在软质角和角的骨膜中特异性表达，表达量与羊角的性状和大小呈负相关。近年来发现RXFP2可能影响牛科动物的角的发育。Allais-Bonnet等通过对有角和无角90天胎牛角芽和额头皮肤组织的研究发现RXFP2参与了牛角芽的分化。赵娟花发现RXFP2基因在有角牦牛角基组织中mRNA相对表达量显著低于无角牦牛。

慢病毒载体作为一类由慢病毒改建而来的慢病毒载体，与其他逆转录病毒相比，慢病毒载体具有以下优点：（1）慢病毒载体携带并整合进入宿主细胞的目的基因对转录沉默作用有一定的抵抗能力，可以在靶细胞中得到持续高效稳定的表达；（2）转染效率高，可感染分裂期和非分裂期细胞；（3）可容纳较大的基因片段。小发夹RNA（shRNA）是一种具有发夹状结构的小分子RNA，它通过RNAi途径使特定基因的表达沉默。shRNA可构建成相应的载体，载体导入细胞后，能在细胞内稳定地转录生成shRNA，并进一步加工生成靶基因特异性siRNA，因此可以发挥长期抑制靶基因表达的作用。慢病毒载体与shRNA干扰的结合，已成为目前研究基因功能的常用研究工具。

发明内容

本发明目的是提供一种干扰牦牛RXFP2基因表达的shRNA，以及利用该shRNA构建的慢病毒介导的牦牛RXFP2基因干扰载体及应用。

本发明的第一个方面，提供了：

一种抑制牦牛RXFP2基因表达的shRNA，选自以下四对中的任意一对：

第1对：上游序列是SEQ ID NO.1，下游序列是SEQ ID NO.2；

第2对：上游序列是SEQ ID NO.3，下游序列是SEQ ID NO.4；

第3对：上游序列是SEQ ID NO.5，下游序列是SEQ ID NO.6；

第4对：上游序列是SEQ ID NO.7，下游序列是SEQ ID NO.8。

在一个实施方式中，所述的shRNA优选第4对。

本发明的第二个方面，提供了：

包含有上述的shRNA的载体。

在一个实施方式中，所述的载体是指hU6-MCS-CMV-ZsGreen1-PGK-Puro质粒。