[发明专利]一种猪凝血酶的制备方法

权利要求书

1.一种猪凝血酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)血浆的制备

向收集的新鲜猪血中加入柠檬酸钠溶液，15℃以下，离心分离血红细胞和血浆，所得血浆置于-20℃冻存；

2)S/D法病毒灭活

将经过室温解冻的血浆用定性滤纸过滤，所得滤液加入曲拉通X-100和磷酸三丁酯，搅拌3～6小时；

3)凝血酶原粗品制备

将经过S/D灭活处理的血浆用定性滤纸过滤，所得滤液中加入DEAE Sephadex A-50凝胶，搅拌；过滤，弃去滤液；配置0.01～0.1moL/L的柠檬酸钠、0.05～0.8moL/L氯化钠溶液的高盐洗涤液，先用高盐溶液淋洗凝胶除去杂蛋白；再用高盐溶液洗脱液浸泡凝胶10～20分钟，过滤，重复三次或三次以上，收集滤液；

4)凝血酶激活液制备

向上述滤液中加入氯化钙溶液，调整滤液中Ca⁺的浓度最终调节为0.02～0.15moL/L，25℃～32℃搅拌激活0.5小时；

5)凝血酶纯化

以Sp-Sepharose FF填充的柱子，将上述凝血酶激活液按1:3～6的比例用柠檬酸钠溶液稀释，上样；上样完毕后用高盐洗涤液淋洗≥3个柱体积，洗涤杂蛋白；再用高盐洗涤液洗脱2个柱体积，收集凝血酶纯品；

6)超滤脱盐

将上述收集液进行超滤脱盐；

7)纳米膜除病毒

将DV20NI0552纳滤膜正确安装后，给储液罐中的超滤浓缩液加压，维持滤膜前后的压差在2～5bar，过滤超滤浓缩液，得到凝血酶溶液。

2.如权利要求1所述的猪凝血酶的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中曲拉通X-100和磷酸三丁酯的添加量为0.3％-2％。

3.如权利要求1所述的猪凝血酶的制备方法，其特征在于，所述高盐洗涤液的pH为6～9。

4.如权利要求1所述的猪凝血酶的制备方法，其特征在于，将所述步骤5)中高盐洗涤液中的柠檬酸钠替换为柠檬酸三钠或三(羟甲基)氨基甲烷。