[发明专利]一种猪凝血酶的制备方法

说明书

本发明公开了一种猪凝血酶的制备方法，包括以下步骤：1)血浆的制备、2)S/D法病毒灭活、3)凝血酶原粗品制备、4)凝血酶激活液制备、5)凝血酶纯化、6)超滤脱盐、7)纳米膜除病毒；本发明通过到工艺过程中的两步联合病毒灭活步骤，有效的控制了终产品中的病毒含量，提高了凝血酶的安全性；通过Marker电泳确认(图2)，两步纯化明显提高了凝血酶的纯度，同时控制了S/D的残留，提高了纳滤膜除病毒的效率。

技术领域

本发明涉及一种猪凝血酶的制备方法。

背景技术

凝血酶(Thombin,EC3.4.21.5)是在血液凝固系统中起重要作用的丝氨酸蛋白水解酶，由凝血酶原激活物激活而成，具有较高的专一性，是近年来国内开发的一种新型速效局部止血药，临床上广泛应用于消化道出血和外科手术止血。高纯度的凝血酶在基因工程后序加工处理中具有特殊作用。凝血酶止血机理是促使血液中的纤维蛋白原转化为纤维蛋白，同时促使血小板聚集，加速血液凝固，达到迅速止血的目的。

目前国内外主要从动物血浆几人血浆中制备凝血酶原，再经激活物激活而成为凝血酶。

凝血酶是一种蛋白质，其制备方法一般包括三个基本步骤：即提取、纯化和冻干，中国专利CN201010230028.6的生产包括以下步骤：1)血液中加入抗凝剂，离心分离得血浆；2)血浆加入BaCL2，得到凝血酶原沉淀；3)凝血酶原沉淀用EDTA溶解洗涤离心提纯；4)溶解沉淀，用CaCL2激活，得到凝血酶；专利号CN200510010518.4生产步骤包括1)血液中加入抗凝剂，离心分离得血浆；2)制备猪凝血酶原活酶复合物3)通过等电点沉淀法，离心得到凝血酶原溶液4)用猪凝血酶原活酶复合物激活凝血酶原溶液，得到凝血酶。以上两个专利所得的凝血酶杂蛋白较多，而且未处理凝血酶制剂中可能存在的病毒，存在安全隐患，凝血酶作为血液提取物，属于含病毒高危制品，但工艺中没有病毒灭活步骤，严重影响产品的安全性。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术中制备的凝血酶的杂质较多，而且对凝血酶制剂中可能存在的病毒未做处理，存在安全隐患的缺陷，提供一种猪凝血酶的制备方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：

一种猪凝血酶的制备方法，包括以下步骤：

1)血浆的制备

向收集的新鲜猪血中加入柠檬酸钠溶液，15℃以下，离心分离血红细胞和血浆，所得血浆置于-20℃冻存；

2)S/D法病毒灭活

将经过室温解冻的血浆用定性滤纸过滤，所得滤液加入曲拉通X-100和磷酸三丁酯，搅拌3～6小时；

3)凝血酶原粗品制备

将经过S/D灭活处理的血浆用定性滤纸过滤，所得滤液中加入DEAE Sephadex A-50凝胶，搅拌；过滤，弃去滤液；配置0.01～0.1moL/L的柠檬酸钠、0.05～0.8moL/L氯化钠溶液的高盐洗涤液，先用高盐溶液淋洗凝胶除去杂蛋白；再用高盐溶液洗脱液浸泡凝胶10～20分钟，过滤，重复三次或三次以上，收集滤液；

4)凝血酶激活液制备

向上述滤液中加入氯化钙溶液，调整滤液中Ca⁺的浓度最终调节为0.02～0.15moL/L，25℃～32℃搅拌激活0.5小时；

5)凝血酶纯化

以Sp-Sepharose FF填充的柱子，将上述凝血酶激活液按1:3～6的比例用柠檬酸钠溶液稀释，上样；上样完毕后用高盐洗涤液淋洗≥3个柱体积，洗涤杂蛋白；再用高盐洗涤液洗脱2个柱体积，收集凝血酶纯品；

6)超滤脱盐

将上述收集液进行超滤脱盐；