[发明专利]玉米籽粒中叶酸的提取和定量方法

权利要求书

1.玉米籽粒中叶酸的定量方法，其特征在于，包括如下步骤：

标准曲线绘制：用提取液将待测叶酸的标准品溶液稀释为梯度浓度，向每个浓度的标准品溶液中加入内标，然后分别进行HPLC–MS/MS检测，建立标准品和内标的相对响应值与标准品和内标的相对浓度之间的标准曲线方程；所述待测叶酸为5-M-THFGlu₁、THF、5,10-CH=THF、10-F-FA、5-M-THFGlu₂、5-M-THFGlu₃、5-M-THFGlu₄、5-F-THFGlu₁、5-F-THFGlu₂、5-F-THFGlu₃、5-F-THFGlu₄、FA；

叶酸提取：包括如下步骤：

（1）取玉米籽粒冻干粉，加入新制的提取液，超声涡旋后，置于100℃温度下震荡10min，冰上迅速冷却；

（2）加入α-淀粉酶，37℃下恒温震荡酶解30 min；

（3）加入蛋白酶，37℃下恒温震荡酶解60 min；

（4）离心，取上清液，即得；

所述提取液的配方为：每100 ml提取液中含有NaH₂PO₄ 249-349 mg，Na₂HPO₄·2H₂O659-759 mg，L-抗坏血酸1-1.2 g，2-巯基乙醇0.4-1.0 ml，pH 6.8-7.0；

每毫克玉米籽粒冻干粉使用10-15 μL的提取液，0.48-0.72个酶活力单位的α-淀粉酶，0.0021-0.0028个酶活力单位的蛋白酶；提取时在提取液中加入内标；

叶酸定量：对提取物进行HPLC–MS/MS检测，得到待测叶酸和内标的相对响应值；将待测叶酸和内标的相对响应值以及内标的浓度代入所述标准曲线方程中，计算得到待测叶酸的浓度；其中HPLC采用C18色谱柱，流动相A为0.1%（v/v）甲酸水溶液，流动相B为0.1%（v/v）甲酸乙腈溶液；流动相梯度变化如下：

时间/分钟	流动相B（%）
0	5
2	9
9	9.6
9.2	20
13.2	20
14	5

。

2.根据权利要求1所述的定量方法，其特征在于，每毫克玉米籽粒冻干粉加入13μL的提取液，0.48个酶活力单位的α-淀粉酶，0.0021个酶活力单位的蛋白酶。