[发明专利]玉米籽粒中叶酸的提取和定量方法

说明书

本发明涉及植物叶酸提取，具体涉及一种玉米籽粒中叶酸的提取和定量方法。包括如下步骤：取玉米籽粒冻干粉，加入新制的提取液，超声涡旋后，置于100℃温度下震荡10min，冰上迅速冷却；加入α‑淀粉酶，37℃下恒温震荡酶解；加入蛋白酶，37℃下恒温震荡酶解；离心，取上清液，即得；所述提取液的配方为：每100ml提取液中含有NaH₂PO₄ 249‑349mg，Na₂HPO₄·2H₂O 659‑759mg，L‑抗坏血酸1‑1.2g，2‑巯基乙醇0.4‑1.0ml，pH 6.8‑7.0。本发明同时准确定量了玉米籽粒中12种不同尾数、不同氧化态的叶酸，为叶酸代谢物的动态分析提供了技术支持。

技术领域

本发明涉及植物叶酸提取，具体涉及一种玉米籽粒中叶酸的提取和定量方法。

背景技术

叶酸是一类水溶性维生素(VB9)，包含叶酸、四氢叶酸及其相应的衍生物。作为一碳代谢的核心辅酶因子，叶酸在一碳循环以及DNA、氨基酸、蛋白等生命物质的合成中发挥着重要的作用。在动植物生长发育过程中，不同尾数、不同氧化形式的叶酸具有不同的生物活性，对动植物的生长发育至关重要。作物是人类和动物获取叶酸的主要来源，然而，作物中的叶酸含量较低，尤其是在谷物中的含量更低。因此，通过基因工程和育种技术来提高植物体内的叶酸水平成为了研究热点，如何获得作物中各种叶酸衍生物含量的可靠数据成为这一研究领域的关键。然而，由于天然样品中的叶酸含量低并且存在多种不稳定的衍生物，致使作物中各种叶酸的准确定量面临很大的挑战。

此前已报道过生菜、花椰菜、细菌中的5-甲基四氢叶酸(5-M-THF)及其多谷氨酸衍生物的定量。但针对作物中天然的多谷氨酸5-甲酰四氢叶酸的定量少有报道。Campos等^[1]通过比较婴幼儿配方奶粉在双酶处理和三酶处理下的单谷氨酸5-甲酰四氢叶酸含量，利用差值表征其多谷氨酸盐的含量，但缺乏对不同尾数多谷氨酸5-甲酰四氢叶酸的具体定量。Haandel等^[2]通过比较多谷氨酸蝶酰和4-氨基-10-甲基蝶酰六谷氨酸在LC-MS/MS中的响应因子，推测相应的多谷氨酸5-甲酰四氢叶酸的响应因子并进行定量，这一方法缺乏足够的准确性。

在各种生物体中，叶酸的代谢过程十分复杂，各种叶酸衍生物的含量和稳定性各不相同，准确检测叶酸及其衍生物的含量十分困难。与细菌基质相比，植物基质的组成更为复杂。不同的植物基质中，叶酸衍生物的组成和含量均不相同。在提取过程中，叶酸容易被植物组织中的淀粉包裹，因此，高淀粉作物(例如玉米、土豆、莲藕)中的叶酸比低淀粉蔬菜(例如菠菜、生菜)中的叶酸更难以提取。

玉米是我国重要的粮食作物，研究玉米籽粒中的叶酸代谢，对于以营养为导向的生物育种具有重要意义。然而，要准确定量玉米籽粒中的叶酸及其衍生物，提取方法是关键，因为叶酸提取的质量直接影响到总叶酸及各种叶酸衍生物的测定结果。迄今，对多谷氨酸5-甲酰-四氢叶酸(5-F-THF)的定量少有报道，因其面临如下多种挑战：(1)含量低于多谷氨酸5-M-THF，更低的含量带来更大的提取和检测难度；(2)叶酸的多谷氨酸形式在高温下不稳定，极易分解；(3)多谷氨酸叶酸易被内源性的γ-谷氨酸水解酶水解。此外，检测技术对叶酸的定量同样重要。微生物检测法是叶酸检测中使用最多的方法，并收入了美国官方分析化学家协会^[3]和美国谷物化学师学会^[4]制定的推荐标准。然而，微生物方法具有分辨率低、线性范围窄的缺点，并且不能区分不同形式的叶酸。

为了准确检测玉米籽粒中叶酸及其衍生物的含量，需要有针对性地建立一种稳定可靠的叶酸检测体系。

发明内容

为满足上述领域存在的需求，本发明提供一种能够同时准确定量玉米籽粒中12种不同尾数、不同氧化态叶酸的方法。

本发明请求保护的技术方案如下：

从玉米籽粒中提取叶酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：