[发明专利]一种基于数据库基因挖掘方法获得的亮氨酸脱氢酶

权利要求书

1.一种基于数据库基因挖掘方法获得的亮氨酸脱氢酶，其特征在于，所述亮氨酸脱氢酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。

2.一种编码权利要求1所述亮氨酸脱氢酶的基因，其特征在于，所述亮氨酸脱氢酶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2。

3.一种含有权利要求2所述亮氨酸脱氢酶基因的表达载体。

4.一种含有权利要求3所述表达载体的重组菌，其特征在于，所述重组菌由表达载体转化宿主细胞制得。

5.根据权利要求1所的亮氨酸脱氢酶，其特征在于，所述亮氨酸脱氢酶的制备方法为：

(1)构建重组菌，将亮氨酸脱氢酶基因连接到表达质粒载体pET-28a(+)上，得到包含亮氨酸脱氢酶基因的重组质粒pET-28a(+)-LeuDH，然后将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，得到重组菌BL21(DE3)/pET-28a(+)-LeuDH；

(2)培养重组菌，将重组菌接种于50mL灭菌后的LB液体培养基中，37℃，180rpm条件下过夜培养，按照1％的接种量将种子培养液接于含有50μg·mL^-1卡那霉素的50mL的LB液体培养基中培养至OD600为0.4～0.6时，加入终浓度为0.3mM的IPTG 25℃诱导15h；

(3)收集亮氨酸脱氢酶，培养后的重组大肠杆菌细胞冷冻离心，并用生理盐水清洗两次，用测定酶活力的缓冲液充分悬浮细胞，超声波破碎细胞，破壁后的菌体12000rpm冷冻离心10min，收集上清液，得到亮氨酸脱氢酶酶液。

6.根据权利要求5所述的亮氨酸脱氢酶，其特征在于，步骤(3)中所述离心条件为8800rpm的转速下离心10min；所述缓冲液为1M的NH₄Cl-NH₃·H₂O缓冲液，其pH值为8.5；所述超声条件为200W，超声1s，间歇2s，共10min。